刘炜 姜金生 韦英杰
[摘要] 目的 探讨白杨素在大鼠体内的代谢产物。 方法 给药组以白杨素2 mg/mL的溶液灌胃雄性SD大鼠，同时空白组大鼠以等体积的溶剂灌胃。灌胃24 h后分别取两组大鼠的尿液和粪便，同时分别于给药后0.5、1、2、4、6 h对两组大鼠进行眼眶取血。应用液质联用推测化合物的可能结构。 结果 在大鼠尿、粪便、血浆检测到原型成分白杨素M1（白杨素），在大鼠粪、胆汁中检测到M2（白杨素硫酸结合物）；此外，在大鼠尿液、血、胆汁等样品中检测到代谢成分M3-M4（白杨素葡萄糖醛酸结合物）。 结论 白杨素在大鼠体内的主要代谢方式为Ⅱ相代谢，产物是葡萄糖醛酸结合物与硫酸结合物。
[关键词] 白杨素；代谢；大鼠；LC-MS
[中图分类号] R969.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）03（a）-0028-04
Metabolites analysis of chrysin in rat by high performance liquid chromatography–electrospray mass spectrometry
LIU Wei1，2 JIANG Jinsheng3 WEI Yingjie2，3
1.Jiangsu Province Hospital of TCM， the Affiliated Hospital of Nanjing University of TCM， Jiangsu Province， Nanjing 210029， China； 2.School of Pharmacy， Nanjing University of Traditional Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing 210023， China； 3.Key Laboratory of Oral Drug Delivery System of Chinese Meteria， Medica of State Administration of Traditional Chinese Medicine， Jiangsu Branch of China Academy of Chinese Medical Science， Jiangsu Province， Nanjing 210000， China
[Abstract] Objective To study the metabolism of chrysin in rats. Methods Drug group was given intragastric administration with chrysin solution 2 mg/mL， at the same time blank group was given intragastric administration with equal volume of solvent. Urine and feces of the two groups were taken after all rats were administered 24 hours later， at the same time at half an hour， 1 hour， 2 hours， 4 hours， 6 hours of the medicine given， all rats were performed orbital blood. Through LC-MS， according to the information， the possible structures of the compounds were speculated. Results In rat urine， feces and plasma， prototype components chrysin M1 was detected， M2 was detected in fecal bile （chrysin sulfate conjugates）； in addition， M3-M4 metabolites were detected in rat urine， blood and bile samples （chrysin glucuronide）. Conclusion The main metabolism method of chrysin in rats is phase Ⅱ metabolism， the metabolites are glucuronic acid conjugate and sulfuric acid conjugate.
[Key words] Chrysin；Metabolism；Rat；High performance liquid chromatography—electrospray mass spectrometry
白杨素（chrysin）（图1），是一种具有广泛药理活性的黄酮类化合物。白杨素的化学名为5，7-二羟基黄酮[1]。白杨素具有抵抗癌症、降低血压、延缓衰老、扩张血管等药理活性[2-3]。白杨素在体内其5、7位羟基易被糖基化代谢导致活性降低[4-7]。对其结构进行有效修饰，特别是在抗肿瘤方面结构修饰的研究非常活跃[8]，对获得高效低毒的新型候选药物具有重要意义。
白杨素由Caco-2和鼠肝细胞代谢为葡萄糖醛酸结合物和硫酸结合物[9-10]，文献[11]报道了人口服白杨素400 mg后血浆、尿液和粪样中的代谢产物，结果在血浆中检测到白杨素及白杨素硫酸结合物（chrysin sulphate），硫酸结合物的含量是原型成分的30倍，在尿液中检测到白杨素及白杨素葡萄糖醛酸结合物（chrysin glucuronide），葡萄糖醛酸结合物的量是原型成分的10倍，同时通过对大鼠粪便样品的检测，发现其中含有大量的白杨素；此外在大鼠胆汁中也发现了高浓度白杨素葡萄糖醛酸结合物的存在。说明白杨素在体内生物利用度低，主要由粪便排出体外。大鼠口服白杨素与人空肠微粒体或大鼠肠微粒体共孵育后，产生两种单葡萄糖醛酸结合物[12]。文献[13]报道了大西洋鳉鱼对白杨素的代谢，在鱼胆汁中检测到很少量原型白杨素，但却检测到两种含量很高的葡萄糖醛酸结合物。课题组前期研究发现，白杨素经模式生物斑马鱼代谢后产生两种单葡萄糖醛酸结合物和一种硫酸结合物[14]。
为了系统了解白杨素的代谢规律，本实验采用的方法是电喷雾质谱联用技术（LC-ESI-MS）与高效液相色谱法[15-16]，用以检测大鼠尿、粪便、血浆和胆汁中白杨素的代谢产物，进而推测出大鼠体内白杨素的代谢途径，为之后的科研奠定了基础[17-19]。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂
对照品：白杨素（S36906）（纯度>97%，江苏万邦生化医药股份有限公司）；肝素（江苏万邦生化医药股份有限公司），生理盐水（南京小营药业集团有限公司，批号：2010070203）；乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；超纯水（Milli-Q）。其余试剂为分析纯。
1.2 动物
SD大鼠6只，雄性，年龄6个月，清洁级，健康状态良好，体重（250±50）g，来源：上海斯莱克实验动物有限责任公司。实验动物许可证号：SYXK（苏）2007-0026。
1.3 仪器
天平型号：METTLER AB135-S型（1/10万，梅特勒-托利多仪器有限公司），高速离心机型号：TGL-16G型（上海安亭科学仪器厂）；低速自动平衡离心仪型号：TDZ5B-WS（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；MS3旋涡混合器（德国IKA公司）；氮吹仪型号：Orga-nomation N-EVAP TM 112（美国Organomation公司）。
液相色谱-质谱联用仪型号：Waters Alliance 2695-ZQ 2000（美国Waters公司），色谱工作站：Masslynx 4.0。
1.4 供试药制备
称取白杨素适量，以0.8%CMC-Na为溶剂配制成含白杨素2 mg/mL的溶液，供大鼠灌胃用。
1.5 分析条件
1.5.1 液相分析条件 色谱柱：Agilent SB-C18 柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），柱温：25℃；流动相：0.05%甲酸乙腈-0.05%甲酸水；采用梯度洗脱：0～5 min，90%B，5～7 min，90%～80%B，7～20 min，80%～75%B，20～35 min，75%～25%B，35～37 min，25%～10%B，37～40 min，10%B。流速：1 mL/min。
1.5.2 质谱分析条件 电喷雾离子源的各项参数中锥孔电压：35 V（ESI-）（ESI负离子模式）、30 V（ESI+）（ESI正离子模式）；离子源温度：120℃；辅助气温度：310℃；毛细管电压：2.50 kV；干燥气流流速：320 L/h；离子极性设定为：负离子（negative）扫描模式；离子检测方式：全扫描（SCAN）模式，离子化方式：气动辅助电喷雾离子化模式（ESI），扫描范围：从100 m/z至800 m/z，提取离子流（TIC）：[M-H]-，[M+HCOO]-。
1.6 给药方法和样品采集
1.6.1 大鼠尿样 取SD大鼠6只，雄性，体重（250±50）g，实验分组为白杨素给药组与空白对照组，随机平均给予每组3只大鼠。需注意实验前12 h禁食但不禁水。给药组分别一次灌胃3只大鼠以0.8%CMC-Na溶液配制的25 mg/kg白杨素溶液，同时空白组灌胃3只大鼠等体积0.8%CMC-Na水溶液。24 h后，同时分别收集6只大鼠的尿液。立刻将收集到的尿液保存在-70℃冰箱中以备用。
1.6.2 大鼠粪便 上述SD大鼠在收集24 h尿液的同时，分别收集这6只大鼠24 h内的粪便。同样，立刻冷冻保存在-70℃冰箱中以备用。
1.6.3 大鼠血浆 在收集上述6只大鼠尿样和粪便同时，分别在给药0.5、1、2、4、6 h，以眼眶采血方式采集大鼠血液样品，置于装有肝素的试管中，混匀抗凝。将血液样品进行离心操作， 3000 r/min离心10 min后取上清液，将各时间点血浆分别合并，立即放入-70℃冰箱中冷冻保存以备用。
1.6.4 大鼠胆汁 上述6只大鼠在上述实验后，经过10 d以上的恢复期开展下一步实验。禁食不禁水12 h，肌肉注射1 g/kg浓度的乌拉糖溶液麻醉，麻醉后进行腹部胆管插管手术。待大鼠清醒时，白杨素给药组给以0.8%CMC-Na溶液配制的25 mg/kg的白杨素溶液，空白组则给以与给药组等体积的0.8%CMC-Na水溶液，于给药12 h后分别收集各鼠的胆汁，立刻放入-70℃冰箱中冷冻保存以备用。
1.7 样品处理
1.7.1 大鼠尿样、血浆、胆汁处理 分别取白杨素给药组的3只大鼠在各个时间段收集的尿液、血浆、胆汁2 mL，加入3倍体积的乙腈后，置于涡旋振荡仪上涡旋混匀3 min，随后3000 r/min离心10 min后用移液枪取上清液，转移到EP管中，随后在40℃条件下用氮气吹干，接着在残渣中加入1 mL乙腈溶解，再13 000 r/min离心15 min后取上清液，精密量取20 μL用高效液相色谱的方法进行检测分析。空白对照组同法处理。
1.7.2 大鼠粪便 分别取白杨素给药组的3只大鼠在各个时间段收集的粪便样品进行混合，置于研钵中进行研碎，精密称取2 g，加入10倍量的70%乙腈浸泡后超声30 min，3000 r/min离心10 min后取上清液，转移到EP管中，用氮气吹干（条件为40℃），在得到的残渣中加入2 mL乙腈，溶解后再13 000 r/min离心15 min后取上清液，精密量取20 μL后用高效液相色谱的方法进行检测分析。空白对照组同法处理。。
2 结果
在“1.5”项下的分析条件下，对白杨素给药组大鼠尿液、粪便、血浆和胆汁的成分进行LC-MS分析：采用负离子模式检测白杨素及其代谢产物。与空白组对照，提取离子流，根据负离子模式分子离子峰[M-H]-、[M+HCOO]-推测出可能分子量，检出代谢产物。
2.1白杨素在大鼠体内代谢产物的分析
检测出白杨素在大鼠的4个代谢产物为M1～M4。大鼠血浆、尿液、胆汁和粪便的总离子流图（TIC）及代谢产物提取离子流图（EIC）见图2。
在大鼠尿、粪便、血浆检测到原型成分白杨素M1，准分子离子峰[M-H]-253.1，[M+HCOO]-299.3，分子量为254；在大鼠粪、胆汁中检测M2，分子量均为334，准分子离子峰为[M-H]-333.0，同时中性丢失80 Da而得到碎片峰[M-H]-253.1，因此推测该代谢物为白杨素（MW254）与硫酸的结合物；此外，在大鼠尿液、血、胆汁等样品中检测到代谢成分M3-M4，准分子离子峰为[M-H]-429.3，同时中性丢失176 Da得到碎片峰[M-H]-253.1，分子量为430，据此，推测为白杨素（MW254）与葡萄糖醛酸的结合物及其异构体。白杨素及其代谢产物质谱数据见表1，质谱图见图3。
实验结果表明，白杨素在大鼠体内主要以Ⅱ相代谢为主，白杨素可以原型存在，5或7位羟基与葡萄糖醛酸、硫酸形成结合型代谢产物。
3 讨论
本研究通过液质联用技术精确系统地检测了白杨素在大鼠血浆、胆汁、尿和粪便中的代谢产物，发现白杨素在大鼠体内主要以Ⅱ相代谢反应为主；并且大部分是以葡萄糖醛酸结合物和硫酸结合物的形式存在，葡糖醛酸结合反应要显着强于硫酸结合反应。这符合文献[2]、文献[9-11]和文献[20]的研究发现，同时也验证了作者团队前期斑马鱼对白杨素代谢的合理性[16]。本研究较为全面地反映了白杨素在大鼠体内的代谢途径。
白杨素及其衍生物具有广泛的药理活性，其在体外具有较强的抗肿瘤活性，然而，由于白杨素在肠道内难以吸收或发生代谢，因此生物利用度较低。严重限制了其临床应用。尽管近年来白杨素已成为新型抗癌药物的研究热点，然而关于白杨素体内过程的研究较少，白杨素衍生物的体内过程研究亦然。研究中发现白杨素在鱼胆汁中有 2 个葡醛酸结合型代谢产物和痕量的原型药物，白杨素主要分布在肝脏，是其他组织的 10 倍左右； 5， 7-甲氧基白杨素在鱼体内的代谢很少，大部分以 5， 7-甲氧基白杨素为主，以及少量葡醛酸结合型代谢产物， 5， 7-甲氧基白杨素主要分布在肝脏和大脑组织中。白杨素其他衍生物的体内代谢还未见报道。受限于大鼠与人类的机体差异性，在后续研究中应着重研究白杨素在大鼠与人体内吸收、分布、代谢与消除的速率及方式的异同。为白杨素药理药效学研究、毒理安全性评价及结构修饰提供更充分的理论依据。
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（收稿日期：2015-11-18 本文编辑：赵鲁枫）
