马 雪 董莹莹 刘 鹏 唐 灵 党永辉.西安交通大学启德书院，陕西西安7006；.西安交通大学第一附属医院精神心理卫生科，陕西西安7006；.西安交通大学医学部法医学院，陕西西安7006
成年期社会隔离对雄性BALB/C小鼠神经行为学的影响
马雪1董莹莹2刘鹏3唐灵1党永辉3
1.西安交通大学启德书院，陕西西安710061；2.西安交通大学第一附属医院精神心理卫生科，陕西西安710061；3.西安交通大学医学部法医学院，陕西西安710061
目的探讨成年期社会隔离对雄性BALB/C小鼠神经行为学的影响。方法8周龄的雄性BALB/C小鼠随机分为群养组（GH组，n=16）和社会隔离组（SI组，n=16）。群养组作为对照，每笼饲养4只小鼠；社会隔离组单只单笼饲养。在40 d的社会隔离后进行一系列行为学测试，包括开放旷场实验（OFT）、新异物体辨别实验（NORT）、高架十字迷宫实验（EPMT）、强迫游泳测试（FST）、T迷宫（TMT）、社会互动测试（SIT）和入侵者诱发攻击实验（IEAT）。比较两组各测试结果。结果在FST中，社会隔离组的不动时间显着短于群养组，差异有统计学意义（P＜0.05）；在EPMT中，社会隔离组在开臂停留的时间显着长于群养组，差异有统计学意义（P＜0.05）；在TMT中，社会隔离组的正确率显着高于群养组，差异有统计学意义（P＜0.05）；在SIT中，社会隔离组的社会交往行为的时间显着长于群养组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论雄性BALB/C小鼠成年期社会隔离对其可能具有抗抑郁、抗焦虑、提高学习记忆能力和增加社会交往行为的作用。
社会隔离；成年期；神经行为学；BALB/C小鼠
各种因素造成的长期社会隔离（social isolation，SI）是社会应激的一种类型，比如留守儿童、空巢老人、某些特殊患者在住院期间被迫与人群分离等。社会隔离在某种程度上全部或部分剥夺了人的社会化过程，阻碍了人性的正常形成与发展过程，有可能参与各种精神障碍的发生过程［1］。目前关于社会隔离的动物模型主要集中于啮齿类动物的幼年期和青少年期，研究结果表明社会隔离会引起动物在新环境中自主活动增多［2-8］、焦虑样行为［1-2，4-6，8］、前脉冲抑制降低［1，4，8-9］、攻击行为增加［1，6，10］、学习和记忆能力下降［1，3-4，6，11-12］，还会导致其成年期在新环境中的自主活动增加［13］、焦虑样行为［13-15］、酒精摄取和偏爱增加［14，16］、条件性恐惧反射减弱［14］、潜伏抑制降低［13，17］、以及学习和记忆能力下降［17］。目前关于成年期社会隔离的研究较少，且其对小鼠行为学影响的研究结论有所不同［18-21］。为进一步探讨成年期社会隔离对于啮齿类动物行为学的影响。本研究选取8周龄的雄性BALB/C小鼠建立社会隔离模型，然后通过一系列情绪和认知行为学实验对小鼠进行行为学测试，现报道如下：
1 材料与方法
1.1实验动物
8周龄雄性BALB/C小鼠32只，体重（20±4）g，购自西安交通大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK（陕）2012-003。本实验已获西安交通大学实验动物管理委员会批准，并按动物实验管理条例进行小鼠饲养和管理。饲养条件：室温（23±1）℃，湿度（55±5）%，光暗周期12 h/12 h（光照时间为7∶00～19∶00），动物自由获取水和食物。
1.2实验方法
32只雄性BALB/C小鼠适应环境3 d后，随机分为群养组（GH组，n=16）和社会隔离组（SI，n=16），社会隔离40 d，随机挑选GH组8只和SI组8只，依次进行：开放旷场实验（open field test，OFT），高架十字迷宫实验（elevated plusmaze test，EPMT），强迫游泳测试（forced swimming test，FST），新异物体辨别实验（novel object recognition test，NORT）。随机挑选GH组8只和SI组8只，依次进行：T迷宫（T-maze test，TMT），社会互动测试（social interaction test，SIT），入侵者诱发攻击实验（intruder-evoked aggressive test，IEAT）。采用15周龄CD1雄性小鼠16只，购自北京维通利华有限公司，动物合格证号：SCXK（京）2012-0001。将其作为陌生鼠，用于行为测试中的社会互动测试与入侵者诱发攻击实验。每笼4只，饲养条件与BALB/C小鼠相同。测试的顺序以其对于小鼠的应激从小到大进行，相邻两个测试的间隔时间为2 d。
1.3行为学测试
1.3.1OFT测定新环境中的自主活动。将小鼠放入旷场实验箱的正中格，让其自由探索1 h。具体实验方法同参考文献所述［10］，记录包括活动的总距离、前10 min进入中央区域的次数和前10min在中央区域停留的时间。
1.3.2EPMT用于检测焦虑样行为。装置包括两个开臂和两个上部敞开的闭臂，开臂和闭臂呈十字交叉状，交叉中心为开阔平台，整个迷宫距地面50 cm。具体实验方法同参考文献所述［10］，记录动物在开、闭臂停留的时间，以及分别进入开、闭臂的次数及其总次数。
1.3.3 FST用于检测抑郁样行为。装置为一透明有机玻璃桶，水温恒定。具体实验方法同文献［10］所述，记录小鼠6min内的累计不动时间。
1.3.4NORT用于检测再认记忆。实验装置为一敞箱。测试分三个阶段：适应，训练，保持。具体实验方法同文献［10］所述，记录每只动物探究每一物体（面对、触或嗅）的时间，分别为T1、T2；记录保持阶段小鼠探究新换的和原有的物体的时间，分别为T3、T4。小鼠的物体识别能力以分辨指数来评价，计算公式为：DI=（T3-T4）/（T3+T4）［10］。
1.3.5SIT用于检测社会交往行为。测试前，原住雄性BLAB/C小鼠在测试笼中单独饲养2 d。具体实验方法同文献［10］所述，记录社会交往行为：紧随、审视等行为持续的时间。
1.3.6IEAT用于检测冲动/攻击行为。用尚未对同伴表现出攻击行为的雄性CD1小鼠作为入侵鼠。具体实验方法同文献［10］所述，记录分析打斗、撕咬行为持续的时间和竖尾的次数。
1.3.7TMT控制进食，使体重保持在非禁食小鼠体重的85%。具体实验过程同文献［22］所述。最后记录16次延迟位置匹配训练中正确的次数（n），正确率为n/16［22］。
1.4统计学方法
采用统计软件SPSS 15.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料以率表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1社会隔离对小鼠自主活动的影响
在OFT中，群养组和社会隔离组活动的总距离、前10 min进入中央区域的次数和前10min在中央区域停留的时间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。
表1 两组小鼠在旷场实验中的探索活动和自发活动路程结果（±s）
表1 两组小鼠在旷场实验中的探索活动和自发活动路程结果（±s）
组别动物只数总距离（cm）前10min进入中央区域的次数前10min在中央区域停留的时间（s）群养组社会隔离组t值P值7 6 12136.59±977.25 13291.22±842.93 0.900 0.392 16.00±7.58 10.50±2.52 0.688 0.532 4.43±2.03 2.52±0.86 0.988 0.352
2.2社会隔离对小鼠抑郁样行为的影响
在FST中，群养组小鼠的在6 min内不动时间显着长于社会隔离组小鼠［（20.57±5.90）比（5.17±2.86）s］，差异有统计学意义（t=2.224，P=0.048）。
2.3社会隔离对小鼠焦虑样行为的影响
在EPMT中，群养组和社会隔离组进入开臂次数和进入闭臂次数比较，差异无统计学意义（P＞0.05），两组在闭臂停留的时间差异无统计学意义（P＞0.05）。社会隔离组在开臂停留的时间显着性长于群养组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），社会隔离组进入闭臂和开臂的总次数显着性高于群养组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。
2.4社会隔离对小鼠学习记忆的影响
在NORT中，在训练和测试阶段，群养组和社会隔离组对物体探索时间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。两组辨别指数差异无统计学意义（P＞0.05）。在TMT中，社会隔离组的正确率显着性高于群养组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。
2.5社会隔离对小鼠社会交往行为的影响
在SIT中，社会隔离组的5 min内社会交往行为的时间显着性长于群养组［（48.58±6.96）比（26.39± 4.84）s］，差异有统计学意义（t=2.707，P＜0.05）。
表2 两组小鼠在高架十字迷宫实验中探索活动结果（±s）
表2 两组小鼠在高架十字迷宫实验中探索活动结果（±s）
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表3 新异物体辨别实验和T迷宫实验结果（±s）
表3 新异物体辨别实验和T迷宫实验结果（±s）
组别动物只数T迷宫实验正确率（n=8）新异物体辨别实验训练阶段探索时间（s）测试阶段探索时间（s）辨别指数群养组社会隔离组t值P值7 6 26.2±6.30 28.37±2.82 0.297 0.422 32.25±6.54 24.95±5.55 0.835 0.772 0.17±0.20 0.51±0.16 1.293 0.223 0.32±0.04 0.46±0.04 2.292 0.041
2.6社会隔离对小鼠攻击行为的影响
在IEAT中，群养组和社会隔离组攻击行为时间［（0.63±0.42）比（0.24±0.24）s］和竖尾次数［（14.63± 2.56）比（10.33±1.48）次］比较，差异无统计学意义（t= 0.474，P=0.474；t=1.454，P=0.174）。
3 讨论
本研究目的是探究成年期社会隔离对雄性BALB/C小鼠行为学的影响。在FST中，社会隔离组小鼠6 min内的不动时间显着减少（P＜0.05），说明社会隔离具有抗抑郁样行为的作用。在EPMT中，社会隔离组在开臂停留的时间显着性长于群养组（P＜0.05），说明社会隔离具有抗焦虑样行为的作用；社会隔离组进入开臂和闭臂的总次数显着性多于群养组（P＜0.05），说明社会隔离组的活动性高于群养组。在TMT中，社会隔离组的正确率显着性高于群养组（P＜0.05），说明社会隔离组的空间学习记忆能力提高。在SIT中，社会隔离组的社会交往行为显着性多于群养组（P＜0.05），说明社会隔离具有增加其社会交往行为的作用。在NORT中，两组辨别指数的差异无统计学意义（P＞0.05），但有趋势说明社会隔离组的辨别指数高于群养组。对于攻击行为，在IEAT实验中，社会隔离组和群养组的攻击行为都很少，二者之间的差异无统计学意义（P＞0.05），说明社会隔离对于其攻击行为的影响较小。综上可知，成年期社会隔离对雄性小鼠可能具有抗抑郁样、焦虑样行为、提高空间学习记忆能力、以及增加社会交往行为的作用。这与以往对C57BL/6品系成年小鼠和Sprague-Dawley品系成年大鼠的研究结果有所不同［18，20］。
以往的成年期社会隔离的研究结果表明，对7～8周龄的Sprague-Dawley大鼠进行10～12周的社会隔离后，发现SD大鼠会产生焦虑样和快感缺乏样行为［18］，以及对8周龄的雌性C57BL/6小鼠进行8周的社会隔离后，发现社会隔离会使小鼠产生抑郁样行为、PPI降低等异常行为学［20］。对12周龄的C57BL/6小鼠进行3个月的社会隔离后，可发现被隔离小鼠中脑表观遗传学的改变［19］。而对于成年Wistar大鼠单独隔离30～31 d后，活动性增强，但是其在中央区域所经路径占总路径之比与对照组相比，无明显差异，提示成年大鼠隔离后与对照组有着类似的焦虑水平，而且社会隔离组的大鼠氧化代谢明显受到抑制［21］。在对成年斑马鱼90 d的社会隔离后，结论表明社会隔离对其有抗焦虑作用，暗示标准密度的生活环境对斑马鱼可能是一种不良的应激源，而且其5-HT水平有所下降［23］。这说明成年期社会隔离对动物的影响存在品系和性别的差异。
社会隔离对小鼠行为的影响与大脑的不同发育阶段密切相关。大脑突触和受体的产生及消除主要发生在从儿童期、青春期向成年期转变的过程，这也是大脑发育最为关键和敏感的阶段，应激在这些阶段对大脑的作用表现出与对成熟大脑不同的影响和作用规律。相对于成年动物，环境应激对未成年动物的行为和神经生理产生更为强烈和持久的影响［24］，但在成年期，大脑突触和受体的产生和消除仍存在，所以环境应激会对成年动物的行为学造成一定的影响［25］。目前关于社会隔离的研究主要集中于幼年期（断乳后21 d）和青少年期，实验动物被隔离的时间集中于4～6周，也有短期隔离为2周［24］。所以，本研究选取成年雄性BALB/C小鼠的社会隔离进行了相关研究，此项研究对社会隔离这一研究起到一定的补充作用。本研究进行社会隔离的时间为40 d，相比于以往的研究，社会隔离的时间较短，且选取的动物品系、性别有所不同［18-21］，所以实验结论有所差异。曾有研究表明，富足的生活条件对于接受慢性温和应激的青少年期雌性BALB/C小鼠的行为和神经可塑性有保护作用［26］。本研究组分析可能是因为实验动物成年后长期处于单养环境，食物、饮水供给充分，这有可能会对啮齿类的天性产生一定的影响，一定程度上掩盖了其寻求维持自己生存条件的本能，同时造成动物对于社会交往的需求有所增加。此外，单笼饲养的相对富足生活条件使成年小鼠更易获得食物，减少了与同伴之间的竞争，可能会对小鼠的情绪和认知有促进作用。关于产生这种现象可能的分子机制目前研究较少，接下来本研究组将会尝试这方面的研究。
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Effects of social isolation on neuroethology in adultmale BALB/C m ice
MA Xue1DONG Yingying2LIU Peng3TANG Ling1DANG Yonghui3
1.Qide College，Xi＇an Jiaotong University，Shaanxi Province，Xi＇an 710061，China；2.Department of Psychiatry，First Affiliated Hospital of Xi＇an Jiaotong University，Shaanxi Province，Xi＇an 710061，China；3.College of Medicine and Forensics，Health Science Center of Xi＇an Jiaotong University，Shaanxi Province，Xi＇an 710061，China
Ob jective To investigate effects of social isolation on neuroethology in adultmale BALB/C mice.M ethods 8 weeks old male BLAB/Cmicewere randomly separated into housed group group（GH group，n=16）and social-isolated group（SIgroup，n=16）.GH group were as control，4 mice in each cage，and mice of SIgroup were amouse in single cage.A series of behavioral testswere performed after 40 d，including open field test（OFT），novel object recognition test（NORT），elevated plusmaze test（EPMT），forced swimming test（TST），T-maze test（TMT），social interaction test（SIT）and intruder-evoked aggressive test（IEAT）.The results of two groups were compared.Results In the FST，the immobility time of the SIgroup was significantly less than that of the GH group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.In the EPMT，the duration time in the open arms of SI group was significantly more than GH group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.In the TMT，SIgroup exhibited higher accuracy than GH group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.In the SIT，SI group displayed more social interaction than GH group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion Social isolation in adulthood may have antidepressant，antianxiety，improving cognitive function and enhancing social interaction behaviors effect on adult male BALB/Cmice.
Social isolation；Adultmice；Neuroethology；BALB/Cmice
R338
A
1673-7210（2016）06（c）-0013-05
国家自然科学基金资助项目（81371473）。
党永辉（1974-），男，博士，副教授；研究方向：神经科学。
（2016-03-20本文编辑：苏畅）
