安媛+++张铮++杜彬++杨云霜++付晓菲+++冯博++任召祺+++杨超
[摘要] 目的 探讨低温保存对围生期间充质干细胞（P-MSCs）体外培养的生物学特性的影响。 方法 从脐带组织分离、培养P-MSCs，取第3代细胞梯度降温冻存后于液氮深低温保存6个月后复苏。比较低温保存前后PMSCs的增殖活性、细胞衰老情况、细胞表面标志物及向脂肪和成骨方向分化的潜能。未经低温保存的第3代P-MSCs作为对照。 结果 低温保存的P-MSCs增殖活性、衰老率与未冻存细胞相比差异无统计学意义（P > 0.05）。低温保存的P-MSCs表达间充质干细胞的表面标志CD44、CD90和CD105，且能够向成骨和脂肪细胞分化。 结论 低温保存复苏后间充质干细胞仍保持良好的体外生长特性和多向分化的潜能。
[关键词] 围生期间充质干细胞；低温保存；生物学特性
[中图分类号] R394.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）04（c）-0004-04
[Abstract] Objective To investigate the effects of cryopreservation on biological features of perinatal mesenchymal stem cells （P-MSCs）. Methods P-MSCs were isolated from human umbilical cord and subcultured in vitro. The third-generation P-MSCs were frozen with a controlled rate freezer and thawed 6 months after liquid nitrogen storage. The effect of cryopreservation on P-MSCs viability， senescence-associated β-gal activity， cell surface markers and adipogenic and osteogenic differentiation property were evaluated. The third-generation P-MSCs without storage were taken as control. Results After cryopreservation， P-MSCs remained maintained a growth rate similar to the P-MSCs without storage， also had the similar senescence-associated β-gal activity （P > 0.05）. The P-MSCs after cryopreservation also highly expressed CD44， CD90 and CD105， and had the adipogenic and osteogeic differentiation potential. Conclusion P-MSCs maintain their biological characteristics and have the differentiation potential after cryopreservation and thawing.
[Key words] Mesenchymal stem cells； Cryopreservation； Biological features
间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一群具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的成体干细胞[1]。MSCs在特定的诱导条件下能够分化形成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等，也可横向分化成多种胚层来源的细胞，如胃肠道上皮细胞、肝细胞、表皮细胞、肺泡、胰腺和神经细胞等[2-6]。此外，MSCs对造血恢复、免疫炎症反应和血管发生等发挥着重要的调节作用[7-9]。MSCs除具有以上的生物学特性外，还易于外源基因的感染和表达，且携带的外源基因表达具有明显的组织特异[10]。围生期间充质干细胞（perinatal mesenchymal stem cells，P-MSCs）是从人脐带、胎盘和脐带血等围生期组织获得的间充质干细胞，取材方便，在组织工程学、细胞治疗等领域显示出非常巨大的研究和应用前景[11-12]。研究显示，P-MSCs已经应用于神经系统疾病、心血管疾病、糖尿病及自身免疫性疾病的临床试验，具有十分广阔的应用前景[13-15]。
细胞的制备技术具有多样性和复杂性，国家药监局相继出台了一系列干细胞应用的指导原则[16]，规范了干细胞临床研究和应用行为，以确保干细胞治疗的安全性和有效性。目前，长期保存干细胞的方法通常是建立干细胞库，低温保存，以满足在需要时进行择期细胞移植。低温保存效果的优劣直接影响着P-MSCs的数量和质量。因此，低温保存后的P-MSCs是否能够存活并保持其生物学特性是其临床应用的重要因素。
1 材料与方法
1.1 材料
围生期组织由火箭军总医院妇产科提供，征得产妇本人的知情同意，经过火箭军总医院伦理委员会批准同意。产妇28岁，孕39周+2，乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等病毒学检测均阴性。ɑ-MEM、特级胎牛血清均购自Gbico公司；细胞培养板/皿购自Corning公司；胶原酶、胰蛋白酶、碱性磷酸酶试剂盒和化学试剂均购自Sigma公司；细胞衰老β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；CD44、CD90和CD105抗体购自BD公司。
1.2 方法
1.2.1 P-MSCs的分离、培养 无菌条件下，将新鲜的脐带组织置于含有双抗的无菌生理盐水中浸泡30 min，用组织镊剥离华通氏胶和脐带动静脉，漂洗后用手术剪刀将脐带剪成1 cm3的小块，置于离心管中加入适量的Ⅰ、Ⅳ混合型胶原酶，置于37℃的孵箱中消化30～40 min后，终止消化，3000 r/min离心20 min，弃上清，用完全培养基（90% ɑ-MEM+10%特级胎牛血清）重悬细胞，接种于75 cm2培养瓶，置于37℃、5%CO2孵箱中培养。72 h后细胞换液，此后每1～2天换液1次。
