钱伟++蒋志涛++潘金火++杨锐++张月婵
[摘要] 目的 建立妇舒保凝胶的质量标准。方法 TLC法用于鉴别黄柏、苦参、大黄；采用HPLC法测定处方中大黄的主要成分大黄酸、大黄素甲醚和黄柏的主要成分盐酸小檗碱的含量。结果 黄柏、苦参、大黄的薄层斑点清晰，阴性无干扰；大黄酸、大黄素甲醚、盐酸小檗碱分别在5～30、4.19～25.14、14.58～174.99 μg/mL范围内线性关系良好，含量分别为0.0277、0.0249、8.709 mg/g，方法加样回收率分别为98.37%、98.1%、97.9%。结论 本试验结果可靠，方法可行，可作为妇舒保凝胶的质量控制方法。
[关键词] 妇舒保凝胶；TLC；盐酸小檗碱；大黄酸；大黄素甲醚；HPLC
[中图分类号]R944 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）04（c）-0142-05
[Abstract] Objective To establish the quality standard of Fushubao Gel. Methods Phellodendri Chinensis Cortex， Sophorae Flavescentis Radix， Rhei Radix et Rhizome were identified by TLC. The contents of Hydrochloric acid Berberine， Rhein and physcion were determined by HPLC. Results The TLC spots were clear and the blank test showed no interference. The linear ranges of Hydrochloric acid Berberine， Rhein and physcion were 5-30， 4.19-25.14， 14.58-174.99 μg/mL respectively. The content were 0.0277， 0.0249， 8.709 mg/g. The recoveries were 98.37%， 98.1%， 97.9% respectively. Conclusion The method is reliable and accurate，and can be applied as the quanlity control method for Fushubao Gel.
[Key words] Fushubao Gel； TLC； Hydrochloric acid Berberine； Rhein； Physcion； HPLC
妇舒保凝胶处方来源于江苏省中医院临床验方，处方组成为：黄柏、苦参、大黄、虎杖、五倍子、冰片等10味中药。经过长期的临床实践，证明本方具有清热燥湿、凉血活血、祛腐生肌、收敛止血之效，临床用于治疗衣原体、支原体感染以及宫颈炎、宫颈糜烂、阴道炎等[1-2]。妇舒保凝胶是采用水溶性基质，将中药饮片经过提取精制的药粉，加适宜附加剂而制成的中药凝胶剂[3-5]。凝胶剂是一种适用于中药外用的理想剂型，有较好的生物相容性，无油腻感，有利于药物的释放。我们对该制剂进行开发研究，本试验建立了该制剂的质量标准。
1 仪器与材料
1.1 仪器
Waters2695 高效液相色谱仪，Waters 2998 紫外检测器，Empower 色谱工作站；AUX220 分析天平（SHIMADZU）；800型电动离心沉淀机（江苏省江阴市保利科研器械有限公司制造）；薄层色谱成像系统（大昌华嘉商业（中国）有限公司）；Drict-Q5超纯水机（法国Millipore公司）。
1.2 材料
盐酸小檗碱（批号：110713-200911），苦参碱（批号：111575-200502），大黄素（批号：110756-200110），大黄酸（批号：110757-200206），大黄素甲醚（批号：110758-201013），芦荟大黄素（批号：110795-200605），大黄酚（批号：110796-200309），以上对照品均购买自中国食品药品检定研究院。处方中所有中药饮片均来自于张家港市中医医院药剂科，符合2015年版《中国药典》一部项下规定。甲醇、乙腈均为色谱纯，购自德国默克；水为超纯水；其余所用化学试剂均为分析纯。
2 方法及结果
2.1 薄层鉴别
2.1.1黄柏的鉴别
2.1.1.1对照品溶液 用甲醇配制盐酸小檗碱对照品，制成约0.5 mg/mL的标准品溶液。
2.1.1.2供试品溶液 分别精密称取妇舒保凝胶（3个不同批号）各0.5 g，用10%NaCl溶液1 mL进行沉析后加甲醇10 mL，超声10 min（频率为40 kHz，功率为250 W），取出，滤过，溶剂蒸干，残渣加1 mL甲醇配制成供试品溶液。
2.1.1.3阴性对照液 按照处方配比取除黄柏以外的其他药材共0.2 g，用与供试品制备相同方法，制备阴性对照液。
2.1.1.4 薄层鉴别 吸取上述各种溶液5 μL，在同一块硅胶G板点板，展开剂为苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水（6∶3∶1.5∶1.5∶0.5），并置氨蒸气饱和缸内展开，置365 nm紫外灯下检视[6]。结果黄柏供试品与其对照药材、对照品在相对应位置处显同样荧光斑点，而阴性对照液在相应位置无此斑点。
2.1.2 苦参的鉴别
2.1.2.1对照品溶液 取苦参碱对照品，加甲醇制成约1.0 mg/mL的标准品溶液。
2.1.2.2供试品溶液 分别精密称取妇舒保凝胶（3个不同批号）各1 g，加入10%NaCl溶液1 mL，沉析，再加入氯仿30 mL和浓氨试液0.6 mL，超声20 min（频率为40 kHz，功率为250 W），过滤得续滤液，取20 mL挥干，残渣加氯仿1 mL制成供试品溶液。
2.1.2.3阴性对照液 按照处方配比取除苦参以外的其他药材共0.2 g，用供试品相同方法制备阴性对照液。
2.1.2.4薄层鉴别 吸取上述各种溶液5 μL，在同一块硅胶G板点板展开，展开剂为苯-醋酸乙酯-丙酮 -浓氨（2∶4∶3∶0.1），取出晾干，喷碘化铋钾显色，检视[7]。结果供试品、对照品在同一位置显红褐色斑点，阴性对照在相应位置没有此斑点。
2.1.3大黄的鉴别
2.1.3.1对照品溶液 分别取对照品（大黄素、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素和大黄素甲醚）适量，加甲醇配制成约0.5 mg/mL的标准品溶液。
2.1.3.2供试品溶液 分别精密称取妇舒保凝胶（3个不同批号）各1 g，加入10%NaCl溶液1 mL，沉析，转移至10 mL容量瓶，超声10 min（频率40 kHz，功率250 W），取出，过滤得续滤液，将其中溶剂蒸干，残渣加水10 mL、盐酸1 mL，加热30 min后置冰水中迅速冷却，加乙醚萃取（2次，10 mL/次），合并乙醚液，继续蒸干，残渣加1 mL氯仿制成供试品溶液。
2.1.3.3阴性对照液 按照处方配比取除大黄以外的其他药材共0.2 g，用供试品相同方法制备阴性对照液。
2.1.3.4薄层鉴别 吸取上述各种溶液5 μL，在同一硅胶H薄层板上点样，薄层板以羧甲基纤维钠为黏合剂，展开剂为石油醚-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1），展开，取出晾干，检视[8-9]。结果大黄供试品、对照药材在同样位置显5个同样的橙黄色斑点；并与对照品在同样位置上显同样的橙黄色斑点。
2.2含量测定
2.2.1盐酸小檗碱的含量测定
2.2.1.1色谱条件 SunFire C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流动相为乙腈（25%）-0.05%磷酸二氢钾（75%），检测波长为345 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为30℃[10]。
2.2.1.2 供试品溶液制备 取妇舒保凝胶样品1.0 g，精密称定，置具塞平底烧瓶中，加入10%的NaCl 10 mL，用力振摇，使沉析，过滤得续滤液，加入10 mL 1%盐酸甲醇溶液，超声10 min（频率为40 kHz，功率为250 W），定容于50 mL量瓶中，滤过，取续滤液1 mL，挥去溶剂后加甲醇定容至10 mL量瓶中，即得供试样品溶液[11-12]。
2.2.1.3对照品的制备 取盐酸小檗碱对照品，精密称定，加甲醇制得291.65 μg/mL的对照品溶液。
2.2.1.4线性关系的考察 精密吸取上述盐酸小檗碱对照品溶液适量，加甲醇配制成盐酸小檗碱浓度为14.58、29.16、58.33、87.49、116.66、174.99 μg/mL的对照品溶液，分别吸取上述溶液5 μL注入HPLC色谱仪中按“2.2.1.1”项下色谱条件测定，以峰面积（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标，进行线性回归，得标准曲线方程：A=16 144C-40 321，r=0.9994，结果表明盐酸小檗碱在14.58～174.99 μg/mL浓度范围内线性关系良好。
2.2.1.5精密度考察 精密吸取291.65 μg/mL对照品溶液5 μL，按色谱条件在24 h内连续进样6次和6 d内同一时间进样6次，测定峰面积，并计算RSD。结果RSD（日间）=1.28%，RSD（日内）=1.21%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.2.1.6稳定性考察 精密吸取同一供试品溶液5 μL，按“2.2.1.1”色谱条件分别在0、2、4、6、8、12 h测定，并计算相对标准偏差（RSD）。结果盐酸小檗碱的峰面积RSD值为1.41%（n=6），试验结果说明样品溶液在12 h内稳定。
2.2.1.7重复性考察 精密称取6份妇舒保凝胶（同一批号）1.0 g，按“2.2.1.2”方法制备，在“2.2.1.1”项下色谱条件下分别精密吸取10 μL进行测定并计算。结果盐酸小檗碱的平均含量为8.731 mg/g，RSD为1.23%（n=6）。结果表明该方法重复性良好。
2.2.1.8专属性试验 按处方比例，不加黄柏的药材，按照工艺路线制得缺黄柏制剂，再按照供试品的制备方法进行阴性供试样品的制备，并进样测定，结果发现，阴性供试样品溶液色谱图在盐酸小檗碱处无吸收，说明阴性样品无干扰。结果见图1。
2.2.1.9加样回收率试验 精密称定同一批号妇舒保凝胶0.5 g，分别加入盐酸小檗碱对照品，按“2.2.1.2”方法制备，在“2.2.1.1”项下色谱条件下测定并计算。结果平均回收率为97.9%（n=6），RSD=0.98%。
2.2.1.10样品含量测定 分别精密称取三批中试样品（批号：20130921、20130923、20130925）1.0 g，平行三份，按照“2.2.1.2”方法制备，在“2.2.1.1”项下色谱条件下测定，并计算每克凝胶中含有指标成分盐酸小檗碱的量，结果见表1。
由表1可得，每克妇舒保凝胶中所含的盐酸小檗碱的平均值为8.709 mg。根据样品含量测定结果，考虑到药材的来源有一定的不稳定性，为了保证产品的稳定性，以含量测定结果的80%作为下限，即妇舒保凝胶中每l g凝胶所含盐酸小檗碱的含量不得低于6.967 mg。
2.2.2大黄酸和大黄素甲醚的含量测定
2.2.2.1色谱条件 色谱柱 SunFire C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），流动相为甲醇-0.1%磷酸（85∶15），检测波长为254 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为30℃。
2.2.2.2供试品溶液制备 精密称定妇舒保凝胶样品约1.0 g，置具塞平底烧瓶中，加入10%的NaCl 10 mL，用力振摇，使沉析，过滤得滤液，加8%盐酸溶液10 mL，再加CHCl3 10 mL，超声20 min（频率为40 kHz，功率为250 W），用CHCl3萃取（3次，10 mL/次），合并CHCl3液，减压回收溶剂至干，用甲醇定容至10 mL，得供试样品溶液，备用。
2.2.2.3对照品的制备 精密称取对照品适量，加甲醇溶解分别制成含50 μg/mL大黄酸和41.9 μg/mL大黄素甲醚的混合对照品溶液。
2.2.2.4线性关系的考察 精密配制大黄酸和大黄素甲醚的质量浓度分别为5.0、10、15、20、25、30、4.19、8.38、12.57、16.76、20.95、25.14 μg/mL的混合对照品溶液，按上述色谱条件测定，得标准曲线方程。大黄酸：A=24 140C-11 695，r=0.9992；大黄素甲醚：A=3873.8C+54 547，r=0.9992。
2.2.2.5精密度考察 精密吸取6 μL混合对照品溶液，按色谱条件在24 h内连续进样6次和6 d内同一时间进样6次，测定大黄酸和大黄素甲醚的峰面积值并计算相对标准偏差（RSD），结果大黄酸RSD分别为0.70%、0.74%（n=6），大黄素甲醚RSD分别为0.61%、0.54%（n=6）。试验结果表明该仪器精密度良好。
2.2.2.6稳定性考察 精密吸取6 μL供试品溶液，按色谱条件在0、2、4、6、8、12 h进样，测定峰面积并计算相对标准偏差（RSD）。结果大黄酸和大黄素甲醚峰面积RSD值分别为0.86%和0.64%（n=6），表明样品溶液在12 h内稳定。
2.2.2.7重复性考察 取6份同一批妇舒保凝胶样品2.5 g，精密称定，按“2.2.2.2”方法制备，精密吸取10 μL，在“2.2.2.1”色谱条件下测定，结果大黄酸的平均含量为0.0273 mg/g，RSD为0.51%（n=6）；大黄素甲醚的平均含量为0.0246 mg/g，RSD为2.22%（n=6）。表明该方法重复性良好。
2.2.2.8专属性试验 按“2.2.2.2”项制得缺大黄制剂，并进样测定，结果发现，阴性供试样品溶液色谱图在大黄酸和大黄素甲醚处无吸收，说明阴性样品无干扰。结果见图2。
2.2.2.9加样回收率试验 精密称定妇舒保凝胶1.25 g（批号20130921），分别加入大黄素甲醚和大黄酸对照品适量，按上述“2.2.2.2”方法制成供试品溶液，测定并计算加样回收率，结果大黄酸平均回收率为98.37%（n=6），RSD=0.98%；大黄素甲醚平均回收率为98.1%（n=6），RSD=0.99%。
2.2.2.10样品含量测定 精密称取三批中试样品（批号：20130921、20130923、20130925）2.5 g，平行三份，按照上述制备供试品溶液的方法制备，测定峰面积，并计算每克凝胶中含有大黄酸和大黄素甲醚的量，结果见表2。
由表2可得，妇舒保凝胶中每1 g凝胶所含大黄酸和大黄素甲醚的含量分别不得低于0.0222 mg和0.0199 mg（以含量测定结果的80%作为下限）。
3 讨论
本方为黄柏、大黄等10味中药组成的复方制剂，其中黄柏和大黄为方中的君药，黄柏的主要活性成分以具有显着的抗菌消炎作用盐酸小檗碱为主；蒽醌类是大黄的主要活性成分，药理研究表明游离蒽醌类具有明显的抗菌消炎作用。故在含量测定部分，选择了黄柏中的盐酸小檗碱以及大黄中的大黄酸和大黄素甲醚等游离蒽醌类为指标成分[13-16]。
本实验建立了妇舒保凝胶中黄柏、苦参、大黄3味药材的TLC方法，专属性强，重现性好，并且建立了君药中盐酸小檗碱、大黄酸和大黄素甲醚的含量测定HPLC法，规定了妇舒保凝胶中每1 g凝胶所含盐酸小檗碱、大黄酸、大黄素甲醚的含量分别不得低于6.967、0.0222、0.0199 mg。本试验初步建立了妇舒保凝胶质量标准草案。
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（收稿日期：2017-01-20 本文编辑：王 丽）
