刘正峰+郭大东+李姣
[摘要] 目的 观察实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）大鼠闪光视觉诱发电位（F-VEP）和闪光视网膜电图（F-ERG）的改变。 方法 选取雌性Lewis大鼠（6～8周）12只，采用随机数字表法分为对照组和实验组，各6只。实验组大鼠后肢足底、两侧腹壁和躯干上皮下各注射含有光感受器间维生素A类结合蛋白（IRBP，1177-1191）和结核菌素（TB）的完全弗氏佐剂（CFA）乳化液，对照组大鼠不做处理。EAU大鼠模型制备8 d后，用眼底光学相干断层成像术（OCT）、眼底荧光素造影（FFA）及F-VEP和F-ERG等手段观察眼底病变情况。 结果 与对照组大鼠相比，实验组大鼠免疫后第8天眼底彩照、OCT及FFA等检查结果均无明显变化。两组F-VEP结果差异无统计学意义（P > 0.05）；而与对照组大鼠相比，实验组大鼠F-ERG有显着改变，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 免疫后第8天，EAU大鼠视网膜电图已经发生改变，表明EAU大鼠视网膜细胞已经受到损害。
[关键词] 实验性自身免疫性葡萄膜炎；眼底光学相干断层成像术；眼底荧光素造影；闪光视觉诱发电位；闪光视网膜电图
[中图分类号] R773 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）08（c）-0004-05
[Abstract] Objective To observe the changes of flash visual evoked potential （F-VEP） and flash electroretinogram （F-ERG） in experimental autoimmune uveitis （EAU） rats. Methods 12 female Lewis rats （6-8 weeks old） were randomly divided into the control group and the experimental group with a random number table method. Each group included 6 rats. EAU models were induced by injection of interphotor-eceptor retinoid binding protein （IRBP， 1177-1191） supplemented with complete Freund adjuvant （CFA） and tuberculin （TB） at footpads， napes and back of the body； while another 6 rats without any treatment were used as normal controls. After EAU induction for 8 days， both EAU and control rats were examined by Fundus， fundus fluorescein angiography （FFA）， optical coherence tomography （OCT）， F-VEP and F-ERG techniques， respectively. Results Compared with those in control group， the results of rats in EAU group determined by fundus photograph， OCT and FFA had no apparent alterations after induction for 8 days， and no significant difference in F-VEP measurement was found between the two groups （P > 0.05）， however， there was a significant difference for the result of F-ERG between EAU and control groups （P < 0.05）. Conclusion The F-ERG in EAU rats has been apparent changed after EAU induction for 8 days， indicating that the retinal cells have been damaged.
[Key words] Experimental autoimmune uveitis； Optical coherence tomography； Fundus fluorescein angiography； Flash visual evoked potential； Flash electroretinogram
葡萄膜炎是一类主要由T淋巴细胞介导的、可引起视力严重损害的眼科疾病[1]，其导致的盲多为不可治盲[2]，因而给社会和家庭造成了严重的负担[3]。临床研究发现，自身免疫应答可以导致绝大多数的葡萄膜炎[4]。由于人体病理取材研究的困难性，因此，研究人员在体外建立了葡萄膜炎的内源性动物模型——实验性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveitis，EAU）[5]。EAU是以特异性的抗原来免疫敏感品系动物诱导产生的一种组织特异性自身免疫性疾病，诱导的病变主要位于葡萄膜和视网膜，是实验最常用的人类后葡萄膜炎模型，与Vogt-小柳原田（Vogt-Koyanagi-Harada syndrome，VKH）综合征、人类交感性眼炎和眼结节病等有相似的临床和病理特征[6]。1968年，Wacher和Lipton首先创立了EAU的动物模型[7]。EAU是一种成熟的与人类葡萄膜炎相似的动物模型[8]，可以通过几种视网膜抗原被诱导，其中视网膜光感受器间维生素A类结合蛋白（interphotoreceptor retinoid-binding protein，IRBP）和S抗原（S-antigen，S-Ag）是实验室常用的免疫用特征抗原[9]。本文应用IRBP抗原成功诱导了大鼠葡萄膜炎动物模型，并通过眼底彩照、OCT、FFA及F-VEP和F-ERG等技术手段对EAU大鼠发病后眼底的改变情况进行了初步研究，现报道如下：
1 材料与方法
1.1 实验动物与试剂
健康雌性Lewis大鼠，鼠龄为6～8周，购自北京维通利华公司，动物合格证号：NO.11400700037148，水粮充足，12 h光照、12 h黑暗于SPF洁净系统密闭环境中饲养。所有动物实验均符合ARVO对于动物在眼睛和视觉方面应用的要求。每2只大鼠饲养于一笼。结核菌素（Tuberculin，TB）购于美国Difco公司；完全弗氏佐剂（complete Freund adjuvant，CFA）购于美国Sigma公司；IRBP（1177-1191，氨基酸序列：ADGSSWEGVGVVPDV）由上海生工生物公司合成。实验动物的使用和饲养均遵循ARVO关于眼科研究动物实验的要求。
1.2 动物分组及EAU大鼠的诱导
实验分为对照组和实验组，每组大鼠均为6只。EAU模型的制备参照文献[10-11]方法进行。简言之，在Lewis大鼠的后肢足底、两侧的腹壁和躯干上皮下各注射100 μL完全乳化的含有35 μg TB和35 μg IRBP的CFA。对照组注射不含IRBP多肽的TB和CFA溶液。所有实验均在免疫后第8天进行。
1.3 对Lewis大鼠眼底照片、OCT和荧光造影检查
各组大鼠实验前10 min滴加复方托吡卡胺散瞳，再在角膜表面滴加氧氟沙星滴眼液，然后腹腔注射10%的水合氯醛进行麻醉。肌肉松弛情况通过检查四肢是否有抵抗进行判断。将大鼠固定于Micron Ⅳ小动物眼底成像系统仪器小鼠XY调节托盘上，调节高度使眼球对准显微镜头，1档拍摄明场照片。腹腔注射荧光素钠注射液0.2 mL，2档拍摄眼底荧光造影。眼底明场、眼底荧光造影同步拍摄Micron Ⅳ OCT造影检测视网膜厚度。
1.4 F-VEP检查
在完全暗室条件下，对照组和实验组大鼠首先暗适应半小时，然后采用全视野内闪光刺激器给予强度2 cd/sm2、频率2.0 Hz的光刺激，通频带为1～100 Hz，叠加次数64。参考电极置于大鼠嘴里，作用电极不锈钢针直接刺于大鼠枕部两耳连线中点皮下，接地电极刺于大鼠右前肢皮下。试验时，向上的P1波和向下的N1波波形和潜伏期均非常稳定，重复性好，在每只大鼠每只眼睛固定出现。N2波在部分大鼠不是很清晰，故本实验仅对P1波和N1波进行分析。将一只眼睛用黑布完全遮盖，另一只眼睛进行检查，并记录。以每只大鼠每只眼睛两次检查所得均值确定其潜伏期和波幅的99%正常值范围（双侧届值）。潜伏期、波幅分别以ms、μV为单位。
1.5 F-ERG检查
在完全暗室条件下，对照组大鼠和实验组EAU大鼠首先暗适应3 h以上，实验前10 min滴加复方托吡卡胺散瞳，然后将大鼠固定于Micron Ⅳ Ganzfeld ERG系统仪器托盘上，在角膜表面滴黏弹剂，参考电极和接地电极由不锈钢针制成，记录电极为0.2 mm银-氯化银制成的环形电极，尾部、左侧颊部和左眼角膜表面分别安放接地电极、参考电极和记录电极，采用Micron Ⅳ Ganzfeld ERG系统进行最大反应（max-response）、振荡电位（oscillatory potentials，OPs）、杆细胞反应（rod-response）、20 Hz闪烁反应（20 Hz-flicker response）记录和明适应视网膜电图（photopic electroretinograph，pho-t ERG）。杆细胞反应光强为0.011 cd/sm2，pho-t ERG、OPs和20 Hz闪烁反应光强为3.5 cd/sm2。记录ERG的通频带为1～300 Hz，OPs为100～300 Hz。pho-t ERG和20 Hz闪烁反应之前进行10 min的明适应（明适应光强37 cd/sm2）。观察ERG a波、b波、OPs波和20 Hz闪烁反应P1波潜伏期和幅值的变化。应用Micron Ⅳ Ganzfeld ERG系统进行波形幅值和潜伏期的测量。
1.6 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 眼底彩照
两组大鼠的眼底彩照未见明显差异。见图1。
2.2 眼底荧光造影和OCT
对照组与实验组均未见明显荧光的渗漏，OCT也未见明显变化。见图2。
2.3 两组F-VEP和F-ERG比较
对照组和实验组大鼠均可引出典型波形呈N-P-N形状，F-VEP的P1波和N1波波形和潜伏期稳定，重复性好。对照组和实验组P1波和N1波振幅差值差异无统计学意义（P > 0.05）。F-ERG中，对照组和实验组大鼠a波和b波的振幅差值分别为（72.86±6.63）μV和（43.98±13.34）μV，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图3～4。
3 讨论
VEP已经可以成熟运用于多种动物模型视神经功能的测定，在视神经缺血[12]、视神经损伤[13-14]、EAE等模型[15]中均有报道。VEP检测易受仪器、麻醉深度、电极放置位置、瞳孔大小、刺激参数、温度、环境亮度等因素影响，因而各研究机构所得正常参考值差异较大。本实验中严格规定了温度、亮度电极位置等参数，使实验误差尽量减少。结果显示，实验组与对照组F-VEP差异无统计学意义，说明EAU大鼠的视神经没有受到损伤。
ERG是受闪光或模式图形刺激时从角膜电极记录到的视网膜总和电反应，即由闪光刺激引起视网膜各级神经元电活动的综合反应，是从视网膜的细胞水平来评价视神经功能，可反映视网膜各个层次细胞功能状态的客观检查。ERG的a波起源于视网膜光感受器内段，是一种超极化动作电位，可以反映光感受器细胞的生物电活动[16]。ERG的b波一般认为起源于视网膜Müller细胞或双极细胞[17]，其变化可以反映视网膜内核层细胞（主要是双极细胞）的电活动，在视网膜功能的诊断上是一个可靠而灵敏的客观指标。本实验中，EAU大鼠的a波与b波振幅明显降低，说明视网膜的细胞已经受到了损害。
OCT具有非侵入性、非接触性等特点，有高分辨率的组织断层成像优势[18]，可以起到与组织病理学观察结果相一致的作用。目前，OCT已经被应用于EAU小鼠视网膜微结构的破坏成像[19]。本实验应用OCT对葡萄膜炎大鼠的眼底进行相关检查，以明确葡萄膜炎大鼠眼底的改变情况。
临床实践中笔者发现，虽然葡萄膜炎的患者在治愈以后的客观检查中眼底并未发现实质性改变，但是视力却未能提高。本实验研究发现，葡萄膜炎大鼠的ERG发生了明显改变，而FFA、OCT和VEP没有变化，说明葡萄膜炎的发生发展可能影响了大鼠的视网膜细胞的功能。笔者在此前的研究中，应用透射电子显微镜观察发现，Müller细胞中出现髓样小体和RPE细胞中出现线粒体空泡[20]。EAU大鼠ERG的改变，Müller细胞和RPE细胞的受损，可以解释前葡萄膜炎患者在经过治疗后，视力仍然不能恢复到正常的原因。
本研究对IRBP（1177-1191）抗原和TB、CFA诱导的EAU大鼠的眼底病变特点进行了分析，在Lewis大鼠免疫诱导后第8天出现了F-ERG的改变，说明EAU大鼠的视网膜细胞已经受到了损害，该结果可以解释临床上相应的葡萄膜炎患者的症状及病程进展情况。
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（收稿日期：2017-02-24 本文编辑：程 铭）
