秦 艳 陈 莹 刘小燕 彭 敏 周东华
1.南方医科大学附属佛山妇幼保健院病理科，广东佛山 528000；2.南方医科大学附属佛山妇幼保健院妇科，广东佛山 528000
子宫颈病变发展是从低级别鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL）到子宫颈癌相对缓慢的过程。LSIL 患者约57%～61%可自然消退，22%～32%长期持续在LSIL 状态，1%～11%可进展为高级别鳞状上皮内病变（high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL）和宫颈磷癌（squamous cell carcinoma，SCC）[1]。LSIL 本身是一种良性病变，不治疗其自然消退率很高，进展率很低，然而其作为宫颈癌前病变，如不及时干预，部分患者可于7～10 年进展为宫颈癌。日前缺乏明确手段或技术去预测孰进孰退，临床尚缺乏对LSIL 患者转归的细化方案。如何规范化处理LSIL 避免其治疗过度或不足，是一个值得探讨的问题。因此寻找有效的生物标志物来判断LSIL的预后，以实现分类管理和治疗是目前研究的热点。本研究联合检测Cervista 高危HPV 分型（HR-HPV）与CK8/18、P120ctn 表达在预测LSIL 进展和转归中的价值，研究其与LSIL 的相关性，探讨病变结局的好转或恶化。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2012 年12 月～2016 年12 月就诊于南方医科大学附属佛山妇幼保健院同时行液基细胞学检测及组织活检确诊为LSIL 患者119 例，年龄21～50 岁，平均（33.8±7.5）岁。其中进展组28 例，持续组41例，消退组50 例，所有病例追踪随访时间均达2 年及以上。另收集HSILSCC 对照组20 例，正常宫颈（正常对照组）15 例。本研究经我院相关医学伦理委员会批准。
1.2 实验方法
1.2.1 Cervista HR-HPV 检测采用Cervista HRHPV DNA 检测试剂盒（批号：20153404099，Hologic 公司)检测14 种HR-HPV，严格依照试剂盒说明书步骤操作。
1.3 免疫组化结果判读标准
CK8/18 染色阳性为胞浆内见黄色颗粒，参照Carrilho 半定量评判标准[2]，按切片中阳性细胞占所观察同类细胞数百分比，分3 类：＞75%为（+++），5%～75%为（+～++），无着色为（－）。P120ctn 正常表达定位于细胞膜，可少量胞浆表达，表现为棕褐色着色清楚为（+++），宫颈病变时，膜表达下降或缺失表现为细胞膜着色变浅或消失，出现胞浆或胞核染色为（+～++），表达缺失为（-）。
1.4 统计学分析
应用SPSS 17.0 软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；P ＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 LSIL 患者HR-HPV 分型比较
各组HR-HPV 分型比较差异有统计学意义（χ2=12.98，P ＜0.05）。进展组A9 型阳性率均高于A7 及A5/A6 型（χ2=15.33、20.31，P ＜0.05），高于持续组及消退组（χ2=14.67、34.61，P ＜0.05），其中混合感染包含两型或以上同时感染。见表1。
表1 LSIL 患者各亚组HR-HPV 分型的阳性率比较[例（%）]
2.2 各组CK8/18 表达情况
CK8/18 在正常宫颈鳞状上皮不表达；进展组总阳性率高于持续组及消退组（P ＜0.05）。在HSILSCC中有不同程度表达，表达强度随病变级别增高而增强。LSIL 组间总阳性率比较，差异有统计学意义（χ2=18.29，P ＜0.05）。LSIL 组总阳性率与HSILSCC 对照组、正常对照组比较，差异有统计学意义（χ2=29.33、94.50，P ＜0.05）。见表2，图1（封四）。
表2 CK8/18 在各组中的表达情况
2.3 各组P120ctn 表达情况
P120ctn 在正常对照组阳性完全表达，消退组阳性表达率高于进展组及持续组（P ＞0.05）。LSIL 组间比较，差异有统计学意义（χ2=11.84，P ＜0.05）。LSIL组总阳性率低于正常对照组，高于HSILSCC 对照组，差异有统计学意义（χ2=8.19、15.08，P ＜0.05）。见表3、图2（封四）。
表3 P120ctn 在各组中的表达情况
3 讨论
子宫颈病变发展是从LSIL 到宫颈癌相对缓慢过程，早期处理诊断是预防宫颈癌的重要手段。临床医师每天需处理很多宫颈病变患者，尤其是LSIL，LSIL一般无明显临床症状，易被忽略，其自然病程可有3种结局，即消退、持续不变或进展，有些医生为了避免LSIL 进展为HSIL，给患者提供LEEP 术。虽然LEEP术在切除病变的同时，能清除HPV 感染，降低LSIL进展概率，但这种处理方式对一过性感染HPV 患者造成过度治疗、过度消耗医疗资源，并可能使患者发生医源性并发症[3-4]。但目前LSIL 缺乏明确、客观、实用的评价指标，缺乏转归的细化方案。如何规范化处理LSIL 避免其治疗过度或不足，是一个值得探讨的问题。LSIL 特征是基底层/副基底层细胞增殖，可以是很轻微的增殖，最多不超过上皮下1/3 层。大多宫颈LSIL（80%～85%）是由于HR-HPV 的感染。其余的LSIL 为低危型HPV（LR-HPV）感染[5-6]。HPV 感染所引起疾病通常要经过潜伏感染期、亚临床感染期、临床感染期和HPV 相关肿瘤期。并非所有的HPV 感染者均会发展为鳞状上皮内病变和癌症，主要取决于病毒因素（HPV 首次感染时间、HPV 含量水平、HPVDNA 型别），宿主因素（激素和营养状况、免疫功能，妊娠），环境协同因素（与宫颈癌的行为危险因素基本一致）等在多种因素协同下，持续HR-HPV 感染可导致HPV 负荷量的增加，高负荷量HPV 对于宫颈移行上皮细胞的局部长期刺激，从而促进病变的进展[7]。Cervista HR-HPV 筛查技术，初级反应为探针寡核苷酸、Invader 寡核苷酸与DNA 目标序列结合进行切割，次级反应切割片段与荧光素标记的寡核苷酸结合，再与Cleavase 酶识别结合，产生荧光放大信号，检测HR-HPV 的L1、E6、E7 区[8]。每次检测均设置内部质控人组蛋白Ⅱ基因特异的寡核苷酸，可消除因样本量不足导致的假阴性结果；不与LR-HPV发生交叉反应，避免假阳性结果。设立外部质控（阴性对照和阳性对照），保证每次结果的准确性、特异性更高。该技术对宫颈病变的敏感度和阴性预测值均较高，能一次检测由国际癌症研究署确定的14 种HR-HPV，并区分A9、A7、A5/A6 三个型组。有研究表明A9 型组HR-HPV 感染者患宫颈癌或癌前病变的风险更高[9-12]。A9 型组有较高的致病性，较易导致宫颈癌的发生，应对A9 型组HR-HPV 感染者高度重视，提高防治力度，可减少宫颈癌发生。
细胞角蛋白（CK）是一种细胞中间丝蛋白，是上皮性肿瘤较特异的免疫组织化学标志物，具有显着的分子多样性，不同上皮组织和细胞分化的不同阶段表达不同的CK。正常宫颈组织中的各种细胞分别表达不同的CK，在正常宫颈组织向宫颈癌转化的过程中，一些CK 表达会发生变化，并表现出一定规律性，因此CK 可能在宫颈癌诊断和预后判断中发挥作用。目前在人类共发现有54 种基因型，但研究较多的是较早发现的20 种，其分子量为44～66 kDa。CK8 是单层上皮组织细胞内重要的细胞骨架成分，是中间纤维丝蛋白家族的主要成员之一[13-17]。目前有关CK17、CK7、CK13 等在宫颈病变中表达研究较多，CK8/18 鲜有报道。本研究CK8/18 在宫颈组织中阳性表达定位于细胞浆，正常宫颈鳞状上皮不表达；进展组高于持续组及消退组。LSIL 组间，LSIL 与HSILSCC 比较差异有统计学意义，提示CK8/18 表达升高在宫颈病变发生发展中可能存在重要作用，检测CK8/18 可作为预测LSIL 是否进展的辅助手段之一。
P120ctn 为连环素家族成员之一，位于细胞间连接处和细胞核内，能调节钙黏蛋白更新和代谢，在细胞黏附、运动中起重要作用，与细胞迁移、侵袭等有密切关系。P120ctn 在钙黏蛋白依赖性黏附中既有正性调节作用又有负性调节作用。它是钙黏蛋白表达的感受器，是控制钙黏蛋白作用的可变电阻器和调定点。有研究表明[18－20]，P120ctn 通过改变细胞间的粘黏、调控基因的转录和调节细胞周期，影响肿瘤的生物学特性，涉及到细胞的增殖、分化、粘黏、浸润等多个环节，参与肿瘤的浸润和转移，从而影响患者的预后。目前，对在肿瘤的不同时期中，P120ctn 表达及作用途径的差异研究还不十分充分。而这可能说明P120ctn 与肿瘤的分级和患者预后之间的关联，如果能进一步证实P120ctn 的异常表达是肿瘤进展的早期改变，对于宫颈病变是否进展的预测将对患者大有裨益。本研究LSIL 组中消退组P120ctn 阳性表达率高于进展组及持续组，组间比较差异有统计学意义（P ＜0.05）。提示P120ctn 表达降低在早期诊断和监测宫颈病变发生发展中可能存在重要作用，检测P120ctn 蛋白表达可作为预测LSIL 是否进展的辅助手段之一。
本研究为LSIL 患者寻找规范化治疗提供客观的科学依据，制订出个体化治疗或随诊方案，通过多种方法的联合检测，尝试预测LSIL 的进展和转归，探讨LSIL 的转归机制，对疾病进行早期诊断和规范化治疗，减少患者心理恐慌和不必要的检测次数及医疗费用，提高患者的依从性，避免其治疗过度或不足，使更多的LSIL 患者获益，为患者和国家节省后期的医疗费用开支及人力成本，具有良好的经济效益和社会效益。综上所述，联合分析Cervista 高危HPV 分型与检测CK8/18、P120ctn 表达情况可能能够预测LSIL 的预后，有助于LSIL 的分层分流管理诊治。
