张舒羽 许 哲 周守宁 郑卓玲 汤世凡 张 希 黄 民 李嘉丽

1.国家儿童医学中心 首都医科大学附属北京儿童医院临床研究中心，北京 100045；2.中山大学药学院药物代谢实验室中山大学临床药理研究所，广东广州 510006；3.中山大学附属第一医院心脏外科，广东广州 510080

华法林广泛用于人工心脏瓣膜置换术后的抗凝治疗[1]，其治疗窗窄、个体差异大，需根据国际标准化比值（INR）的监测值不断调整剂量[2-3]。华法林的不良反应主要发生在给药初期[4]，因而准确地预测华法林的初始给药剂量和减少华法林抗凝初期的剂量波动是华法林个体化治疗的当务之急。近年来的研究表明，华法林的主要代谢细胞色素P450酶2C9（CYP2C9）以及靶点蛋白维生素K 环氧化物还原酶复合体亚单位1（VKORC1），其基因多态性是造成个体间华法林剂量差异的主要原因。目前尚未见研究探讨遗传因素对华法林抗凝剂量波动的影响[5-7]。本研究以人工心脏病瓣膜置换术患者为研究对象，考察VKORC1和CYP2C9基因多态性对华法林抗凝初期（术后给药90 d）维持剂量及剂量波动的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2014年6月～2016年12月中山大学附属第一医院（以下简称“我院”）心血管外科人工心脏瓣膜置换术患者201例，性别不限，年龄为18～65岁。所有患者均签署知情同意书，试验方案经我院医学伦理委员会批准。所有患者术前采集1～2 mL 静脉血，放置于含有乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）的抗凝管中；术后开始服用华法林钠片（3 mg×100片，芬兰奥利安）；接受90 d 的随访，并按要求复诊调整用药剂量；监测INR 保持在1.8～2.5之间。

1.2 试剂与仪器

聚合酶链反应（PCR）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；限制性内切酶购自美国Thermo Fisher 公司；台式高速低温冷冻离心机（日本HITACHI 公司）。

1.3 基因分型方法

全血样本参照实验室优化的NaI 裂解法[8]提取基因组DNA，VKORC1 rs7294和CYP2C9*3（rs1057910）的基因型采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）进行检测，所用引物及方法参照Cen等[9]、Hadjipanagi等[10]、Turgut等[11]的报道。

1.4 华法林抗凝治疗波动指标

本部分通过以下指标来描述剂量波动：①华法林日剂量波动幅度（dose differerence，DD，mg/d）：在随访期内，最大日剂量与最小日剂量之差，DD=dose maximum-dose minimum。②华法林持久波动日剂量（lasting dose，LD，mg/d）：随访频率和时间间隔相同的前提下，剂量共计发生X 次变动，出现D1、D2……Dx……Dn共计n 个华法林剂量值（X≤n）；D1剂量在总共X 次剂量变动中出现过C1次，C1次总共给药维持天数为L1天，以此类推，Dn剂量在总共X 次剂量变动中出现过Cn次，Cn次总共给药维持天数为Ln天，其中Dx给药维持天数Lx最大，则该Dx为华法林持久波动日剂量（LD）。

1.5 统计学分析

使用SPSS 21.0统计学软件对所得数据进行处理，计量资料的平均水平用均数±标准差（）表示；组间比较采用Kruskal-Wallis 检验。以P ＜0.05为差异有统计学意义；应用Haploview 4.2统计软件对基因型进行哈迪-温伯格平衡（hardy-weinberg equilibrium，HWE）χ2检验，P ＞0.05，说明群体基因遗传符合HWE。

2 结果

2.1 临床资料

本研究共纳入201例患者，其中男性116例，女性85例；平均年龄为（47.9±0.7）岁，平均术后首次华法林剂量为（2.89±0.05）mg/d，首次给药合用可达龙患者17例（8.5%）；平均LD 值为57 d。

2.2 基因型分布频率

VKORC1 rs7294和CYP2C9*3的基因型分布具体如表1所示，本研究群体基因遗传平衡。

表1 VKORC1 rs7294和CYP2C9＊3的基因型分布（n=201）

2.3 VKORC1和CYP2C9基因型对华法林抗凝治疗初期维持剂量LD 及剂量波动DD 的影响

对于VKORC1 rs7294，CT 突变杂合子携带者的LD 为（3.44±0.20）mg/d，CC 野生纯合子携带者的LD为（2.55±0.08）mg/d，两组比较，差异有高度统计学意义（P ＜0.001）。对于CYP2C9*3，*1*3突变杂合子携带者的LD 为（2.85±0.09）mg/d，*1*1野生纯合子携带者的LD 为（2.59±0.21）mg/d，两组比较，差异无统计学意义（P=0.485）。

对于VKORC1 rs7294，CT 突变杂合子携带者的DD 为（2.43±0.12）mg/d，CC 野生纯合子携带者的DD为1.99±0.08 mg/d，两组比较，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。对于CYP2C9*3，*1*3突变杂合子携带者的DD 为（2.10±0.29）mg/d，*1*1野生纯合子携带者的DD 为（2.19±0.08）mg/d，两组比较，差异无统计学意义（P=0.799）。

3 讨论

当前华法林药物基因组学研究主要分为基于现有基因型指导下预测给药剂量模型的前瞻性研究和寻找新遗传因素为目的的回顾性研究[12-13]。本实验室前期前瞻性研究发现：在90 d 随访期内，分别采用遗传因素和临床因素模型预测给药的两组患者华法林剂量变动均超过8次，DD 均超过2 mg/d，跨度从1～9 mg/d，两组比较，差异无统计学意义。这意味着基因型指导下的给药剂量模型尚不能改善传统抗凝方案的剂量波动现状[14-15]。

INR 在治疗范围内的时间（time in therapeutic range，TTR）和稳态剂量两个指标虽然常规被用来评价口服华法林的达标情况和效果差异，但不足以全面体现华法林抗凝效应波动性的个体差异。笔者认为剂量达稳是实际给药剂量围绕持久波动的日剂量上下浮动，逐渐达到最适药物剂量，并趋于稳定的过程，换言之LD持续累计时间最长；同时，最适药物剂量受病理状态、饮食等多因素影响，随时间动态变化，并不是绝对一成不变的[15]。因此，本部分研究以LD 和DD 指征华法林抗凝初始阶段的波动性。

近年来，国内外已有多项研究显示VKORC1和CYP2C9基因多态性是影响华法林稳态剂量大小个体差异的主要遗传因素，但针对这两个基因对华法林抗凝初始阶段的剂量波动性的研究较少[16]。Wypasek等[17]随访3个月发现CYP2C9*3携带者较CYP2C9*1*1的INR 达标百分比明显降低，本研究在考察平均日剂量波动幅度时未见统计学差异，考虑有可能是CYP2C9*3在中国人群中突变率较低，以及本研究人群中CYP2C9*3携带者例数较少所致。Liu等[4]通过监测心脏瓣膜置换术患者给药7 d 内的INR 值，发现达到相同INR 值，VKORC1 rs7294 T 突变基因携带者较CC 野生型携带者需要更高的华法林给药剂量。Wang等[18]以及Chen等[19]分别考察了华法林抗凝治疗3个月以上的稳定剂量，发现VKORC1 rs7294 T 突变基因携带者的稳态剂量也明显高于CC 野生型携带者。本研究发现VKORC1 rs7294 T 突变基因携带者的DD 和LD 显着高于CC 野生纯合子携带者，不仅印证了VKORC1 rs7294对华法林初始抗凝维持剂量大小的影响，也说明VKORC1是影响华法林抗凝波动性的主要遗传因素。

VKORC1 rs7294与华法林抗凝剂量降低和波动显着相关，原因可能是：①VKORC1 rs7294作为VKORC1上游调控区的突变，可能上调了mRNA 的表达，导致维生素K 环氧化物还原成维生素K 醌形式的反应增强，使T 突变基因携带者需要更多的华法林拮抗这一过程[20]；②华法林作为抗凝前体药物，半衰期较长，需待内源性凝血因子消耗尽才能发挥抗凝作用，T 突变基因携带者由于还原维生素K 环氧化物的能力较强，体内凝血因子储量较多，新生凝血因子的能力也较CC 野生型携带者强。因此，VKORC1 rs7294 T 突变基因携带者的DD 明显高于CC 野生型携带者。

综上所述，遗传因素不仅影响华法林初期抗凝剂量大小，也是导致剂量波动个体差异的重要影响因素。本研究从LD 和DD 两个方面考察了华法林抗凝初始阶段给药剂量的波动性，发现VKORC1 rs7294 T突变基因携带者较CC 野生型携带者所需华法林抗凝维持剂量高，更易发生剂量波动，应该加强INR监测。这或是对目前广泛开展的基因型指导下华法林剂量预测给药方案的补充，以期为华法林的长期个体化抗凝治疗、加强患者用药教育和自我管理提供参考和依据。