李 洋 费洪新 张晓杰,3

1.佳木斯大学基础医学院，黑龙江佳木斯 154002；2.新余学院护理与康复学院，江西新余 338004；3.齐齐哈尔医学院病理学院，黑龙江齐齐哈尔 161006

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是当今社会普遍存在的老年严重性疾病，β-淀粉样蛋白（βamyloid，Aβ）是其形成的重要因素[1-2]。小胶质细胞是神经系统的免疫细胞，炎症小体NOD 样受体蛋白3（nod-like receptor protein 3，NLRP3）是AD 激活的危险信号[3-4]。Aβ 可以刺激NLRP3，使小胶质细胞释放炎症介质，引起炎性反应的发生[5-6]。现代医学对于AD的治疗还不够完善，临床用药也有一定的毒副作用，但中医药方剂补肾益智方[7]、七福饮[8]、补阳还五汤[9]等却为AD 的治疗提供了有力的帮助。本实验在前期研究的芪苓益脑汤（QYD）的基础（专利号：ZL20151050 5180.3）上，通过实验检测小鼠大脑皮质区小胶质细胞NLRP3 的表达，从而探究QYD 对AD 小鼠大脑皮质区小胶质细胞NLRP3 表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级3 月龄，雄性，体重（23±2）g，APP/PS1 双转基因小鼠（24 只）和同窝同性别的野生小鼠（8 只）均购自于南京大学南京生物医药研究院[SCXK（苏）2015-0001]。所有小鼠按照清洁级标准在温度18～29℃、相对湿度达40%～70%、无菌、自由摄食饮水的条件下，由齐齐哈尔医学院动物实验中心进行饲养，小鼠灌胃、处死等基本操作均符合动物伦理学基本标准。

1.1.2 主要药品 盐酸多奈哌齐（陕西方舟制药有限公司，H20030583）。QYD 购买于黑龙江中医药大学附属第一医院（以下简称“我院”），QYD 基本组成包括黄芪20 g（1712068S）、山慈菇8 g（160910）、昆布9 g（170501）、大枣10 g（SC11741018400042）、川芎6 g（1705027S）、桂枝6 g（1712070S）、三棱8 g（1507027C）、牡蛎20 g（170901）、知母10 g（1703107S）、土茯苓35 g（1703052S）、白术3 g（1707034CH）、甘草6 g（1712001），每付一共141 g，共购买10 付。组成QYD的中药材由我院栗明副主任医师按照《中国中药材真伪鉴别图典》[10]鉴定为正品后方可配伍使用，QYD 是由齐齐哈尔医学院中医药研究院将组成QYD 的中药材经过浸泡、煮沸、过滤、蒸发等过程，提取浓缩液，制成的水煎剂，该中药组合物已经申请并授权专利（专利号：ZL201510505180.3）。

1.1.3 试剂和仪器 Aβ 抗体（Abcam 公司，ab201060）；NLRP3 抗体（博士德公司，BA3677）；Trizol（碧云天公司，R0016）；HT7700 型透射电子显微镜（日立高新公司）；HH-11420-BS 型电热恒温培养箱（上海五久自动化设备有限公司）；DSX-280B 型手提式压力蒸汽灭菌器（北京慧龙环科环境仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和给药 24 只APP/PS1 双转基因小鼠按照随机数字表法分为模型组、QYD 实验组和多奈哌齐组，每组8 只，另设同窝同性别的8 只野生小鼠作为对照组。按体表面积和剂量换算[11]，QYD 实验组给予QYD（18.330 g/kg）、多奈哌齐组给予多奈哌齐（0.001 g/kg），模型组、对照组给予生理盐水（2 mL/次），每天灌胃1 次，持续灌胃30 d。

1.2.2 行为学检测 参考文献[12]进行行为学测试。Morris水迷宫实验设定的基本条件包括水深20 cm，高于平台1 cm，水温控制在（23±2）℃，水池内放适量奶粉，使其背景变为白色，将平台置于第4 象限，同时保持室内外参照物一致。小鼠先进行4 d 的训练测试，每次60 s。如果60 s 内小鼠搜寻不到平台则停留10 s。第5 天时进行定位航行测试，观察小鼠到达平台的潜伏期，评价小鼠的学习能力；空间探索实验时，实验人员移走平台，将小鼠放入池中，让它们自由游泳60 s，检测小鼠到达平台的游泳距离和穿越平台的次数，以此评价小鼠的记忆能力。

1.2.3 形态学观察 参考文献[13-14]进行形态学观察。透射电子显微镜观察海马区和小胶质细胞结构变化：将水迷宫测试后的小鼠置于超净台上，断颈法取1 mm3的海马组织块，依次完成戊二醛固定，包埋等操作，制成50～70 nm 的超薄切片，电镜观察，拍照存储图像。

1.2.4 蛋白水平检测 免疫组织化学法检测NLRP3、Aβ 表达。行为学检测结束后，将小鼠解剖后断头取脑组织。依次完成固定，包埋，切片，脱蜡，脱水，修复，滴加封闭液，一抗工作液（4℃过夜）等操作，随后辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗孵育，苏木精复染。显微镜下观察，存储图像。应用Image-Pro Plus 6.0 软件计算平均光密度值（MOD）。

1.2.5 基因水平检测 采用实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）方法检测NLRP3、Aβ 基因表达情况。取60 mg 脑组织，加600 μL 的Trizol 溶液，用研磨器迅速研磨，提取RNA。将RNA 反转录成cDNA，同时设计特异性引物Aβ 引物（F：5′-CTGGAGGTGCCCACTGATG-3′ ；R：3′ -GGGTCTGACTCCCATTTTCC -5′ ）、NLRP3（F：5′-GAGCTGGACCTCAGTGACAATGC-3′；R：3′-ACCAATGCGAGATCCTGACAACAC-5′）、GAPDH（F：5′-CGTGCGTGACATCAAAGAGAA-3′；R：3′-AACCGCTCGTTGCCAATAGT-5′）。加入特殊SYBR GreenⅠ荧光材料，通过RT-qPCR 进行实时监测得到实验数据，所得实验数据结果均采用2-ΔΔCt法计算。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件对所得数据进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析，组间比较采用LSD 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 QYD 对AD 小鼠行为学的影响

与对照组比较，模型组AD 小鼠潜伏期明显延长，游泳距离明显增加，穿越平台的次数明显减少，差异有统计学意义（均P ＜0.05）；与模型组比较，多奈哌齐组和QYD 组AD 小鼠潜伏期均明显缩短，游泳距离明显减少，穿越平台的次数明显增加，差异有统计学意义（均P ＜0.05）。见表1。

表1 QYD 对AD 小鼠行为学的影响（，n=8）

表1 QYD 对AD 小鼠行为学的影响（，n=8）

注：与对照组比较，#P ＜0.05；与模型组比较，*P ＜0.05。QYD：芪苓益脑汤；AD：阿尔茨海默病；“-”表示无数据

2.2 QYD 对AD 小鼠大脑皮质区小胶质细胞的影响

对照组小鼠大脑皮质区小胶质细胞形态完整，胞体小且椭圆状，细胞质丰富，小鼠大脑皮质区小胶质细胞结构正常；模型组AD 小鼠大脑皮质区小胶质形态较完整，内质网扩张，线粒体絮状变形，核固缩，有明显脂褐素沉着，小鼠大脑皮质区小胶质细胞结构异常；与模型组比较，多奈哌齐组和QYD 组AD 小鼠大脑皮质区小胶质细胞形态较规则，核固缩减轻，脂褐素少见，小鼠大脑皮质区小胶质细胞结构逐渐恢复。见图1。

2.3 QYD 对AD 小鼠大脑皮质区NLRP3 和海马Aβ表达的影响

与对照组比较，模型组AD 小鼠NLRP3 在部分大脑皮质小胶质细胞表达明显增多（P ＜0.05）；与模型组比较，多奈哌齐组和QYD 组AD 小鼠NLRP3 在部分大脑皮质小胶质细胞的表达明显减少（P ＜0.05）。与对照组比较，模型组AD 小鼠海马区域Aβ 斑块数量明显增多（P ＜0.05）；与模型组比较，多奈哌齐组和QYD 组AD 小鼠海马区域Aβ 斑块数量明显减少（P ＜0.05）。见表2、图2～3。

图1 脑组织内小胶质细胞结构（TEM，18 000×）

图2 各组小鼠小胶质细胞NLRP3 的表达（免疫组化，200×）

图3 各组小鼠海马内Aβ 的表达（免疫组化，200×）

表2 QYD 对AD 小鼠大脑皮质区NLRP3和海马Aβ 的影响（，n=8）

表2 QYD 对AD 小鼠大脑皮质区NLRP3和海马Aβ 的影响（，n=8）

注：与对照组比较，#P ＜0.05；与模型组比较，*P ＜0.05。QYD：芪苓益脑汤；AD：阿尔茨海默病；NLRP3：NOD 样受体蛋白3；Aβ：β-淀粉样蛋白；MOD：平均光密度值；“-”表示无数据

2.4 QYD 对AD 小鼠大脑皮质区NLRP3 和海马Aβ mRNA 的影响

与对照组比较，模型组AD 小鼠大脑皮质区NLRP3和海马Aβ mRNA 表达均明显升高，差异有统计学意义（均P ＜0.05）；与模型组比较，多奈哌齐组、QYD 组AD 小鼠大脑皮质区NLRP3 和海马Aβ mRNA 表达均明显降低，差异有统计学意义（均P ＜0.05）。见表3。

表3 QYD 对AD 小鼠大脑皮质区NLRP3和海马Aβ mRNA 的影响（，n=8）

表3 QYD 对AD 小鼠大脑皮质区NLRP3和海马Aβ mRNA 的影响（，n=8）

注：与对照组比较，#P ＜0.05；与模型组比较，*P ＜0.05。QYD：芪苓益脑汤；AD：阿尔茨海默病；NLRP3：NOD 样受体蛋白3；Aβ：β-淀粉样蛋白；“-”表示无数据

3 讨论

AD 是一种常见的神经退行性疾病[15-16]。最近在AD 模型小鼠中，出现了大量与AD 相关的信息，其中对小胶质细胞特异性激活NLRP3 就有了新的研究[17]。被激活的NLRP3 炎症小体能够促进APP/PS1 模型小鼠脑组织内Aβ 沉积，NLRP3 炎症小体的活化是炎性疾病发展中的重要环节，抑制NLRP3 炎症小体的活化可以对AD 疾病进行有效的保护。因此本实验以APP/PS1 双转基因小鼠为模型，验证QYD 是否能够降低NLRP3 的表达，从而验证QYD 是否能增强小鼠学习记忆的能力。

资料显示[18]，当归补血汤可以有效提高APP/PS1小鼠的学习记忆能力，当归补血汤与QYD 的君药相同，QYD 是由当归补血汤中的黄芪并配伍土茯苓等多种中药成分组合而成，具有多靶点性，前期对QYD的研究也已经证实了其对AD 的保护作用。本研究通过对AD 小鼠的水迷宫测试发现，QYD 可以改善AD小鼠的学习记忆能力，具有改善AD 小鼠的行为学的作用，同时由本实验的透射电子显微镜观察结果可知，QYD 也具有改善AD 小鼠大脑皮质区小胶质细胞结构的作用。研究表明，Aβ 及沉积物是导致NLRP3炎症小体增多和AD 疾病发展的重要环节[19-20]。炎症小体现已经成为近年来研究的热点领域，小胶质细胞激活后释放炎性因子也已成为研究热点问题[21-24]。在AD 的疾病研究过程中，Aβ 通过激活小胶质细胞使其释放炎症小体NLRP3，从而使学习记忆能力丧失。通过实验研究可知，QYD 能够有效地抑制AD 小鼠脑组织中的NLRP3 的表达，降低NLRP3 的活化水平。同时QYD 也可以减少小鼠脑组织内Aβ 的沉积，因此，本研究可认为NLRP3 的活化与Aβ 减少密切相关，NLRP3 的抑制可以在很大程度上保护AD 小鼠的记忆丧失和减少Aβ 沉积，QYD 作为抗炎药物，为AD 的疾病治疗提供了可靠的依据。

综上所述，本研究提示QYD 能够抑制NLRP3 活化，这与降低Aβ 沉积有关，验证了QYD 对AD 具有保护作用，这将为AD 的治疗奠定基础。