兰 杨 张仕瑾 王娅俐 郭廷东 唐志立 谢席胜
1.川北医学院第二临床医学院 四川省南充市中心医院药学部个体化药物治疗南充市重点实验室，四川南充 637000；2.川北医学院第二临床医学院 四川省南充市中心医院肾内科，四川南充 637000
黄芪三七合剂处方是四川省南充市中心医院肾内科谢席胜主任医生根据益气养血、活血利水、健脾助运治法结合多年临床经验总结得到的临床验方，该方由黄芪、三七、当归、牛膝、昆布、薏苡仁、山药、甘草等八味中药组成，临床用于治疗3～4期慢性肾脏病，对改善慢性肾脏病患者临床症状以及延缓病情向终末期发展具有显着疗效[1-2]。已有文献报道[3-5]，黄芪中活性成分毛蕊异黄酮葡萄苷具有抗炎、抗病毒、免疫抑制的作用；当归中阿魏酸抗氧化能力较强，能有效地清除多种自由基，同时还具有抗血栓、抗病毒、免疫调节等多种药理活性；三七中人参皂苷Rg1具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保护肾脏的作用。本方以汤剂的形式在临床上使用，由于慢性肾脏病患者需长期服药，汤剂煎煮麻烦，储藏和携带不便。因此，为提高患者顺应性，同时保证临床疗效，在不改变原汤剂物质基础的前提下，将其开发成服用方便、疗效稳定的合剂。本实验以人参皂苷Rg1、毛蕊异黄酮葡萄苷、阿魏酸三者的含量及浸膏得率的综合评分为评价指标，采用正交试验优选提取工艺参数，为该制剂后续研究奠定基础。
1 材料
1.1 仪器
LC-16高效液相色谱仪（日本岛津公司）；TGL-18M台式高速冷冻离心机（盐城市凯特实验仪器有限公司）；BP211D电子分析天平（精密度十万分之一，北京赛多利斯）。
1.2 试药与试剂
阿魏酸对照品（批号：110773-201915）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（批号：111920-201907）、人参皂苷Rg1对照品（批号：110703-202034）均购自中国食品药品检定研究院；实验所用饮片均购自四川省中药饮片有限公司，由四川省南充市中心医院药学部郭廷东主任中药师鉴定，均符合2015版《中华人民共和国药典》[6]相关项下要求。乙腈为色谱纯，水为蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸及人参皂苷Rg1含量测定方法
2.1.1 色谱条件参考相关文献[7-9]，色谱柱为SHIMADZUGL inertsil C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）作为流动相，梯度洗脱：0～18 min，19% A；18～25 min，19%～24% A；25～55 min，24% A；55～60 min，24%～19%A；检测波长：毛蕊异黄酮葡萄糖苷（260 nm），阿魏酸（320 nm），人参皂苷Rg1（203 nm）；柱温：35℃；流速：1 mL/min；进样量：10 μL。
2.1.2 对照品溶液的制备 精密称定毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品、阿魏酸对照品、人参皂苷Rg1对照品适量，置100 mL容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、人参皂苷Rg1分别为46.3、112.3、92.6 μg的混合对照品溶液。
2.1.3 供试品溶液的制备 精密吸取正交试验项下提取液10 mL至25 mL容量瓶中，用75%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
2.1.4 线性关系考察 精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液1、2、4、6、8、10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析。以进样量为横坐标（X），峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得线性范围和回归方程。见表1。结果显示各成分在进样范围内与峰面积呈良好线性关系。
图1 混合对照品、供试品高效液相色谱图
表1 线性范围和回归方程
2.2 评价指标
以处方中有效成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、人参皂苷Rg1的含量以及浸膏得率的综合评分为指标，根据方剂君臣佐使的配伍理念以及各指标在处方中的相对重要性分配权重系数，各指标权重系数依次设为0.5、0.2、0.2、0.1[10-13]。综合评分＝毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量/毛蕊异黄酮葡萄糖苷最大含量×0.5×100+阿魏酸含量/阿魏酸最大含量×0.2×100+人参皂苷Rg1/人参皂苷Rg1最大含量×0.2×100+浸膏得率/最大浸膏得率×0.1×100。
2.3 浸膏得率的测定
取正交试验项下提取液50 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中（A1），水浴蒸干，105℃干燥3 h，置干燥器中冷却至室温，立即称定质量（A2），，A为处方药材质量，U为提取液体积[14-17]。
2.4 正交试验优选提取工艺参数
在前期单因素试验基础上，选择加水倍数、提取时间、提取次数作为正交试验考察因素，因素水平见表2，试验结果见表3，方差分析见表4。试验结果采用SPSS 17.0软件进行统计分析，由表4方差分析结果显示C因素具有显着性（P ＜0.05），A、B因素均无显着性，为了降低生产成本和提高生产效率，确定最佳提取工艺条件为A2B1C3，即加10倍量水，提取4次，每次30 min[18-20]。
表2 正交试验因素水平
表3 正交试验设计及结果
表4 方差分析结果
2.5 验证试验
按上述优选的提取工艺重复3次，依法测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、人参皂苷Rg1含量及浸膏得率。结果，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、人参皂苷Rg1平均含量分别为0.61、1.51、26.23 mg/g，RSD分别为0.94%、1.38%、1.20%，浸膏得率均值为41.02%，RSD为0.71%，综合评分均值为97.74，RSD为0.09%，结果显示优选的工艺参数稳定、重复性较好，可作为黄芪三七合剂的提取工艺。
3 讨论
中药复方常以多组分、多靶点共同发挥疗效，以单一组分或成分为指标来筛选工艺难以反应复方的整体功效[21-23]。目前，多指标综合评分法已广泛应用于中药复方制剂的提取、成型工艺筛选，通过对多个指标成分赋予客观权重系数，计算综合评分，较单一成分评价指标更能全面客观的评价工艺优劣[24-27]。毛蕊异黄酮葡萄糖苷为君药黄芪中有效成分，阿魏酸、人参皂苷Rg1分别为臣药当归、三七中有效成分，浸膏得率影响后续成型工艺。根据方剂君臣佐使的配伍理念以及各指标在处方中的相对重要性，故将四者权重系数依次设为0.5、0.2、0.2、0.1。验证结果显示，工艺合理可行。本研究建立了多波长同时测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、人参皂苷Rg1三者含量的方法，试验过程中对比了等度洗脱和梯度洗脱两种方式，对照品色谱中两种洗脱方式各目标峰分离度均较好，等度洗脱时供试品色谱中目标峰与杂质分离度小于1.5，不符合分析要求，故选择梯度洗脱。同时，考察了甲醇-磷酸水系统、乙腈-磷酸水系统，结果乙腈-磷酸水系统峰型更好，经反复调整流动相比例及多次试验，最终确定了文中色谱条件，方法学验证结果显示所建方法准确度高、重复性好，可用于三者含量同时测定。
