金 琪 郝晓凤 谢立科 孙 梅
中国中医科学院眼科医院眼底病、眼外伤科，北京 100040
视网膜静脉阻塞（retinal vein occlusion，RVO）是仅次糖尿病视网膜病变的视网膜血管疾病。认为RVO的发生与血管炎症、血栓形成、血流动力学障碍有关[1]。眼科临床治疗以玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）药物为主[2]，但需反复注射，增加了眼内炎风险，加剧了经济负担。RVO 属于中医“视瞻昏渺”的范畴，以络脉瘀阻为关键，治法以活血化瘀为第一要义。本团队在探究临床中医药治疗RVO 的组方规律时[3]，发现桃仁-红花药对居于前列。
“药对”又称对药，是介于单位药和复方之间的配伍单元，其临床应用为中医药临证化裁的充分体现。出自《医宗金鉴》的“桃仁-红花”是临床活血化瘀的经典药对之一[4]。桃仁，苦，甘，性平，归心、肝、大肠经，有小毒，活血祛瘀，润肠通便，止咳平喘[5]。红花，辛，性温，归心、肝经，活血通经、祛瘀止痛、解毒[5]。临床以二药为基础的复方（活血明目汤、剔络化瘀方、祛积通络方）治疗RVO 效果确切[6-8]，但具体机制尚不明确。基于此，本研究采用系统生物学的方法探讨桃仁-红花治疗RVO 的作用机制，供临床参考。
1 材料与方法
1.1 筛选药对成分及靶点
在中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmsp.php）分别输入“桃仁”“红花”，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug likeness，DL）≥0.18 为筛选条件，合并，去重，获得桃仁-红花的有效成分及靶点。同时借助Cytoscape 3.7.2 软件获得药对活性成分。
1.2 筛选交集靶点
在GeneCards（https://www.genecards.org/）平台检索“retinal vein occlusion”，获得RVO 的潜在靶点。利用Jvenn（http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）平台，分别导入药对和疾病的靶点，获得交集靶点，并使用STRING（https://string-db.org/）作蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络分析，获得核心靶点。
1.3 交集靶点的富集分析
将交集靶点导入Metascape（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）平台，进行GO 分析和KEGG通路富集分析。
1.4 筛选活性成分
借助Cytoscape 3.7.2 软件整理交集靶点与药对成分，获得排名靠前的药对活性成分，备用。
1.5 分子对接
从PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载活性成分的2D 结构，然后使用Chem3D 对2D 结构加工改造，作为分子对接的配体，在PDB 数据库（http://www1.rcsb.org/）下载核心靶点的结构，应用Pymol、AutoDockTool 等工具进行去水、加氢，作为分子对接的受体，使用AutoDock 软件对成分及靶点进行分子对接，当结合能≤-7 kcal/mol[9]，提示成分与靶点具有较稳定的结合性。
2 结果
2.1 桃仁-红花的有效成分
利用TCMSP 平台，获得23 个桃仁成分，22 个红花成分，合并，去重，获得35 个药对成分，178 个药对靶点。借助Cytoscape 3.7.2 软件拓扑分析，获得排名前10 的活性成分。见表1。
表1 桃仁-红花的活性成分
2.2 桃仁-红花和RVO 的潜在靶点
在GeneCards 数据库，获得1704 个RVO 靶点，以“Relevance score”≥3.92（中位数）筛选，最终获得853 个RVO 靶点。与178 个药对靶点取交集，获得96 个交集靶点，PPI 分析后，排名靠前的核心靶点见图1。
图1 桃仁-红花-视网膜静脉阻塞的交集靶点
2.3 活性成分
整理药对成分和交集靶点，借助Cytoscape 3.7.2 软件，进行拓扑分析，获得排名前10 的活性成分为：槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-胡萝卜素、黄芩黄素、植物甾醇、豆甾醇、6-羟基山奈酚、赤霉素、常春藤皂苷元。
2.4 GO 分析和KEGG 分析
GO 分析分别获得246 个生物过程，61 个细胞成分，111 个分子功能。在246 个生物学过程中，主要包括细胞因子介导的信号通路，对脂多糖的反应，凋亡信号通路，对氧化应激的反应等；在61 个细胞成分中，主要影响膜筏，RNA 聚合酶Ⅱ转录因子复合物，囊泡腔，细胞外基质等；在111 个分子功能中，主要涉及细胞因子受体结合，转录因子结合，蛋白质结构域特异性结合，血红素结合等。GO 分析中3 个部分靠前的10 个序列如图2 所示。KEGG 分析共获得150 条通路，包括AGE-RAGE 信号通路、IL-17 信号通路、PI3K-Akt 信号通路等，摘录前10 条通路见表2。交集靶点标记于糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路图（http：//www.bioinformatics.com.cn/）如图3 所示。
图3 糖尿病并发症的AGE-RAGE 信号途径（灰色方框为桃仁-红花作用的靶点）
表2 交集靶点的KEGG 分析
图2 GO 富集分析图
2.5 分子对接的结果
利用AutoDock 软件，选取排名前3 的活性成分：槲皮素、木犀草素、山柰酚，与交集靶点中排名第一的AKT1 进行分子对接，此次对接的结果AKT1 与槲皮素结合能为-7.64 kcal/mol、AKT1 与木犀草素结合能为-7.69 kcal/mol、AKT1 与山柰酚结合能为-7.21 kcal/mol，提示桃仁-红花的成分进入机体后，能与靶点很好地结合。
3 讨论
本研究发现槲皮素、木犀草素、山柰酚等成分可能是桃仁-红花作用RVO 的活性成分。以往药理研究[10]，槲皮素通过抑制JNK/P38 MAPK 信号通路，缓解氧化应激下视网膜神经节细胞的损伤，下调视网膜内白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8、MCP-1 等因子的水平，保护损伤的ARPE-19 细胞[11]，同时抑制高糖诱导的视网膜新生血管的生成[12]。木犀草素通过下调HMGB1 的水平，减轻对NF-κB 的调控，减轻炎症反应，抑制RPE 细胞的凋亡，保护血-视网膜屏障[13]。山柰酚阻止NF-κB 信号通路的激活，抑制IL-6、IL-8、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎症介质的释放[14]，同时下调VEGF 和PGF的表达，阻止人视网膜内皮细胞的增殖，减少视网膜新生血管形成。
核心靶点主要涉及ALB、AKT1、IL-6 等。ALB[15]是由肝细胞合成的一种多肽，当体内发生炎症时，抑制ALB 合成，同时消耗ALB，诱发低蛋白血症，加剧炎症反应。此外，ALB 是体内的抗氧化池[16]，当ALB缺乏时，LDL 被氧化而具有细胞毒性，刺激单核、巨噬细胞分泌趋化、黏附因子，增加血液的黏稠度，破坏血管内皮[17]，影响血管的通透性。视网膜血管周细胞或平滑肌细胞中的Akt1 会通过调控Ang-1 信号通路，维持血管内皮的稳定性[18]。当Akt1 减少，FoxO 介导的紧密连接蛋白会减少，同时诱导VEGF 的表达，破坏血管内皮屏障[19]。在RVO 中[20]，IL-6 的浓度与症状的严重程度呈正相关。高浓度的IL-6 会刺激VEGF 的分泌，诱导新生血管的生成，影响血流动力学。
对交集靶点进行GO 分析，提示桃仁-红花干预RVO涉及凋亡信号通路，对氧化应激的反应等生物学过程。KEGG 分析显示糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、IL-17 信号通路、PI3K-Akt 信号通路等是桃仁-红花治疗RVO 的主要通路。糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路是血管氧化应激损害的主要机制[21]，且此损害是不可逆的。AGE 的升高会破坏血管内皮，增加血管通透性[22]，RAGE 为AGE 的受体之一，正常状态下含量低，但体内发生各种炎症时，浓度快速升高。AGE 与RAGE 结合，激活RAGE-Nox-NF-κB信号通路[23]，促进VEGF、TGF-β1、MCP-1 等因子的表达，引发氧化应激和炎症反应，破坏血管内皮[24]。将本研究的交集靶点标记于糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路（http://www.bioinformatics.com.cn/），推测桃仁-红花干预RVO 可能与调控血管生成、血栓形成，改善炎症有关。研究显示，较之空白对照组，BRVO 患者的IL-17 水平显着升高，IL-17 促进VEGF、ICAM-1、IL-6 的分泌，促进人视网膜中新生血管的生成[25]。近来研究提出[26]，中医的化瘀疗法可能类似西医的抑制血小板的活化及ICAM-1 等因子的表达。在阻断PI3K/Akt 信号通路后，血小板活化和血栓形成得以抑制，且没有明显的出血倾向[27]，证实了桃仁-红花的化瘀之效。
综上，桃仁-红花通过多成分、多靶点、多通路相互作用RVO，具体机制可能为减少血小板的聚集，改善血流动力学，调节炎症因子的水平，抑制氧化应激信号通络的激活，延缓血管的损伤，促进损伤血管内皮的修复。此研究为进一步探讨桃仁、红花等活血化瘀类药物在治疗眼底血管疾病指明了方向。但是临床辨证施治，往往受到剂型、剂量的影响，故具体考究，还待未来的实验验证。
