闫爽��高孟婷 郑园园 郭娜娜 陈俊雅++耿玲 肖怀 李玥
【摘要】目的：研究从昆虫美洲大蠊和斑蝥中提取的3个活性部位YS-I、YS-II、YS-III对人胃癌细胞MGC-803、人食管癌细胞Eca-109和人肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用。方法：将从昆虫美洲大蠊、斑蝥中提取的3个活性部位分别作用于MGC-803、Eca-109、HepG2细胞株，采用MTT法检测受试物作用24、48、72小时后细胞增殖抑制情况，计算IC50值，并研究其量效、时效关系。结果：3个由昆虫中提取的活性部位对人源MGC-803、Eca-109、HepG2肿瘤细胞株均有一定的增殖抑制作用，并呈现较好的时间依赖和剂量依赖关系。结论：美洲大蠊提取物YS-I及斑蝥不同极性提取物YS-II、YS-III对人胃癌、食管癌、肝癌细胞具有较好的增殖抑制作用，为今后进一步研发昆虫源低毒、高效的抗肿瘤药物奠定了一定基础。
【关键词】 昆虫；美洲大蠊；斑蝥；增殖抑制；抗肿瘤
【中图分类号】R2827407【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）10-0033-05
Proliferation Inhibition of Extracts from Reriplaneta amerlcana and Mylabris on Three Human Tumor Cells
YAN Shuang1，2GAO Meng ting1，2ZHENG Yuanyuan1，2
GUO Nana1，2CHEN Junya2GEN Ling2XIAO Huai1，2，3，4LI Yue1，2，3，4*
1Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D， Dali 671000， China；
2College of Pharmacy and Chemistry， Dali University， Dali 671000， China；
3Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics， Dali 671000， China；
4National-Local Joint Engineering Research Center of Entomoceutics， Dali 671000， China
Abstract： Objective To study the proliferation inhibition on MGC-803 cell、Eca-109 cell and HepG2 cell with three active extracts（YS-I， YS-II， YS-III）from Periplaneta americana and Mylabris Methods To incubate MGC-803、Eca-109 and HepG2 cell with three active extracts from Periplaneta americanaand Mylabrisfor 24，48 and 72 hours， cell proliferation in different concentration and time was determined by MTT assay Calculating IC50 values and study its dose，time-effect relationship Results Three active extracts frominsects have a certain proliferation inhibition on MGC-803 cell， Eca-109 cell and HepG2 cell The inhibition effect had good time-dependent and dose-dependent Conclusion Three active extracts from Periplaneta americanaand Mylabrishave a good proliferation inhibition on MGC-803， Eca-109 and HepG2 cell Laying a foundation for further research and development of low toxicity， efficient insect anti-tumor drugs.
Keywords： Insects； Periplaneta americana； Mylabris； Proliferation Inhibition；Antitumor
恶性肿瘤对人类生命健康危害极大，世界卫生组织发布的《2014年世界癌症报告》提及未来20年每年新发癌症病例将达到2200万，同期癌症死亡数将上升至1300万例[1]。据全国肿瘤登记中心报道，2015年中国有4292万例癌症新发病例，2814万例死亡病例，其中肺癌、胃癌、食管癌和肝癌居于前列[2]。目前国内对肿瘤的治疗方式主要是手术、药物及放射治疗等。癌症中、晚期，化疗和放疗为主要的治疗手段，但化疗和放疗在杀伤肿瘤细胞的同时，往往伴随着严重的毒副作用，对正常细胞也有一定影响，使患者承受着身体和精神上的巨大痛苦[3]。
动物源类中药资源丰富，在我国疾病治疗中的应用有着悠久的历史。近年研究发现多种药用动物中提取的活性成分在体外或体内对肿瘤细胞、荷瘤小鼠肿瘤具有一定的抑制作用[4-6]，且副作用小、相对安全，提示天然动物源抗癌药物具有较好的开发前景。药用斑蝥多为芫菁科昆虫南方大斑蝥（Mylabris phalerata Pallas）或黄黑小斑蝥 （Mylabris cichorii Linnaeus）的干燥体，临床研究表明，斑蝥提取物在治疗尖锐湿疣、斑秃、风湿、肝炎等疑难杂症时效果明显，近年来药理学实验显示斑蝥素及其衍生物对喉癌、乳腺癌、宫颈癌、肝癌等肿瘤细胞有显着疗效[7-9]。美洲大蠊（Periplaneta americana），俗称“蟑螂”，属昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属，现代药理学及临床研究显示其具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗衰老、促进创面愈合、增强肌体免疫力等作用[10-12]，大理大学药化学院工作者致力于药用昆虫研发近30年，何正春等[13-15]将美洲大蠊醇提取物通过聚酰胺柱层析分离划段得到不同部位，采用MTT法检测所得部位对肿瘤细胞的增殖毒性，结果表明美洲大蠊提取物对多种肿瘤细胞具有明显的增殖抑制活性且毒副作用较小，这些研究为开发低毒、高效的动物类抗肿瘤药物打下一定基础。
基于团队前期的研究基础，笔者对大量昆虫来源的提取物进行了细胞毒活性筛选，对于活性明显的样品，再次进行复筛及量效、时效考察。现将来源于美洲大蠊及斑蝥的3个活性样品对人胃癌细胞MGC-803、人食管癌细胞Eca-109、和人肝癌细胞HepG2的生长抑制活性及其量效、时效关系报道如下。
1材料与仪器
11受试样品美洲大蠊提取物活性部位（YS-I）、斑蝥提取物活性部位（YS-II、YS-III）由大理大学昆虫生物医药研究院制备提供。其中YS-I由美洲大蠊乙醇提取物经聚酰胺柱分离，40%乙醇/水部分浓缩、冷冻干燥获得[16]；YS-II为干燥斑蝥虫体粉末用等极性溶剂提取浓缩物，YS-III为干燥斑蝥虫体粉末用低极性溶剂提取浓缩物；具体制备方法因涉保密内容暂不公开。
12试剂RPMI-1640培养液（Gibco）；DMEM培养液（Gibco）；胎牛血清（Gibco）；025 %胰蛋白酶-EDTA消化液（密理博公司）；噻唑蓝（MTT）及二甲基亚砜（DMSO）均购于美国Sigma公司；青霉素、硫酸链霉素（Amersco，美国）；顺铂（DDP，齐鲁制药有限公司）。
13主要仪器SW-CJ-1FD型洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；3111型水套式CO2培养箱（Thermo，美国）；CKX41SF型倒置相差显微镜（Olympus，日本）；SN255939型酶标仪（BIO-TEK，美国）；XK96-3微量振荡器（江苏新康医疗器械有限公司）；BSA124S型电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；YXQ-LS-50S11型立式压力蒸汽灭菌器（上海东亚压力容器制造有限公司）。
14细胞株人胃癌细胞株（MGC-803）、人食管癌细胞株（Eca-109）、人肝癌细胞株（HepG2）均购自中国科学院昆明细胞库。
2方法
21实验原理MTT法是一种快速、简便的体外抗肿瘤药物敏感性测试方法，目前已被广泛用于抗肿瘤药物体外活性筛选实验。它是利用活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶可将黄色的3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide ]（噻唑蓝，MTT）还原为蓝紫色的甲臜（Formazan），甲臜不溶于水，可溶于二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO），通过酶标仪测定其在570nm处的光密度（Optical Delnsity，OD）值可推测活细胞数目，了解受试样品对细胞增殖的作用效果。
22受试样品溶液及阳性对照品溶液的配制样品溶液配制：称取一定量活性样品冻干粉或浸膏，用少量DMSO溶解配制成100mg/mL的储备液，于4℃冰箱保存。实验时用DMEM或RPMI-1640培养液将浓度分别稀释为300、100、50、30、10、3μg/mL。阳性对照品溶液配制：称取一定量DDP冻干粉，配制成10mg/mL的储备液，于4℃冰箱保存。实验时用DMEM或RPMI-1640培养液将浓度分别稀释为5、05、005μg/mL。
23细胞培养HepG2细胞株在含有10%胎牛血清及100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2培养箱中培养。细胞形态为上皮样，贴壁生长，约每2～3日传代1次。MGC-803、Eca-109细胞株均在含有10%胎牛血清及100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，于37℃、5%CO2培养箱中培养。细胞形态为上皮样，贴壁生长，约每2～4天传代1次。
24细胞毒性测试实验取对数生长期的HepG2、MGC-803、Eca-109细胞，制成细胞密度为1×105/mL的悬液，接种于96孔板，每孔100μL，于37℃、5%CO2 的培养箱中培养24h。细胞贴壁后，弃原培养基，每个实验孔分别加入受试样品溶液100μL，每个浓度设置3个复孔，同时设置阳性对照（DDP）、阴性对照（等量不含药物的培养液）和空白对照（只有等量培养基、没有细胞），以上于37℃、5%CO2培养箱中分别继续培养24h、48h、72h后，弃去上清液，每孔加入20μL，5mg/mL的MTT溶液，37℃、5%CO2培养箱中孵育4h，然后每孔加入150μL的DMSO，于微量振荡器上振荡至甲臜完全溶解，在酶标仪上于570nm波长处测定各孔的OD值。
25统计学处理按以下公式计算药物对肿瘤细胞增殖的抑制率（%）：细胞增殖抑制率（%）=（OD阴性— OD样品）/（OD阴性 — OD空白）×100%；以药物浓度的对数值为横坐标，细胞增殖抑制率为纵坐标绘制量效曲线，并分别用SPSS170的Logistic回归模型计算不同作用时间后的半数抑制浓度（IC50）。
3结果
31样品对所选肿瘤细胞的增殖影响效果3个活性样品YS-I、YS-II、YS-III及阳性药DDP对人胃癌细胞株MGC-803、人食管癌细胞株Eca-109、人肝癌细胞株HepG2的IC50值，详见表1。
32样品对所选细胞增殖抑制作用的时效、量效关系分析3个活性样品YS-I、YS-II、YS-III及阳性药DDP对人胃癌细胞株MGC-803、人食管癌细胞株Eca-109、人肝癌细胞株HepG2增殖抑制作用的时效、量效关系分析结果见图1、2、3。
实验结果提示3个昆虫类活性样品YS-I、YS-II、YS-III对人胃癌细胞株MGC-803、人食管癌细胞株Eca-109、人肝癌细胞株HepG2的增殖均具有一定的抑制作用；通过量效和时效关系分析表明，3个样品对所选三株细胞的增殖抑制存在一定的剂量和时间依赖关系。其中YS-I对MGC-803细胞株在处理24h、48h、72h的IC50值分别为1007、973、647μg/mL，已接近阳性药DDP IC50值的1/2至1/3，具有较强的肿瘤细胞增殖抑制作用；对另两株细胞株Eca-109和HepG2，作用72小时后的IC50值也小于20μg/mL，提示YS-I对三株人肿瘤细胞、尤其是胃癌细胞的增殖具有明显抑制作用。
4讨论
蒋永新等[17]研究表明“康复新液”（主要成分为美洲大蠊提取物）有抑制MGC-823肿瘤细胞生长、阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡等作用，梁刚等[18]研究表明美洲大蠊提取物有抑制人肝癌细胞Bel- 7402裸鼠移植瘤生长、下调血管内皮生长因子（VEGF）的作用。YS-I是美洲大蠊聚酰胺有效部位，对人胃癌细胞株MGC-803、人肝癌细胞株HepG2的增殖均具有较好抑制作用，而人胃癌细胞株MGC-803、人肝癌细胞株HepG2分别与MGC-823、Bel- 7402细胞株为同源细胞，推测YS-I抑制肿瘤细胞增殖的机制可能与阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡、下调血管内皮生长因子（VEGF）相关。YS-I尚为多成分混合物，故从其中纯化出具有研究和开发前景的高效抗肿瘤成分值得引起重视。YS-II、YS-III均为斑蝥的有机溶剂提取部位，在配制样品溶液时，会有少量样品析出，这可能会对斑蝥素抑制肿瘤细胞的效果有一定影响。本研究显示，昆虫来源提取物对人肿瘤细胞确实存在明显的抑制（或杀灭）作用，具有对其进行深入研究的科研及临床应用价值。
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（收稿日期：2017-03-22编辑：陶希睿）
