孙佳 田勇 杨淑婷

【摘 要】 目的：建立乳没活络散（Rumohuoluo San）中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量测定方法，以控制产品质量。方法：以高效液相色谱法，采用Inertsil ODS-3（4.6mm×250mm，5 μm），Phenomonex C18（4.6mm×250mm，4μm），Hypersil C18（5.0mm×200mm，5μm），流动相乙腈（A）-水（B）梯度洗脱（0～12min，19%A；12～32min，19%～30%A；32～40min，30%A；40～54min，30%～38%A；54～60min，38%A），检测波长203nm，流速1.0mL/min，柱温45℃，对本方君药三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1特征性成分含量进行同时测定。结果：本方法可同时检测乳没活络散中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1；上述3种成分进样浓度分别在0.04268～0.4268mg/L、0.07564～0.7564mg/L和0.08672～0.8672mg/L时线性关系良好（r> 0.9994），平均回收率分别为100.1%、99.78%和101.4%，RSD 在1.3%～2.5%（n=9）。稳定性方面，3批乳没活络散经过6个月加速试验和24个月长期试验，各项指标均符合要求。结论：所建立的方法专属，准确度、精密度及耐用性良好，可用于乳没活络散的质量控制。乳没活络散质量可控稳定性好。

【关键词】 乳没活络散；高效液相色谱；三七皂苷R1；人参皂苷Rg1；人参皂苷Rb1

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2018）16-0022-04

Abstract：Objective To established a method for the determination of the contents of Notoginsenoside R1， Ginsenoside Rg1 and Rb1 inRumohuoluo San and provide a reference for its quality control.Method High performance liquid chromatography （HPLC） method was employed to simultaneously determine the contents of Notoginsenoside R1， Ginsenoside Rg1 and Rb1 inRumohuoluo San. The HPLC method was performed on Inertsil ODS-3 column （4.6mm×250mm， 5 μm）， Phenomonex C18 column （4.6mm×250mm， 4μm） and Hypersil C18 column （5.0mm×200mm， 5μm） with acetonitrile （A）-water （B） as mobile phase for gradient elution （0～12min， 19%～30%A； 32～40min， 30%A； 40～54min， 30%～38%A； 54～60min， 38%A）. The detection wavelength was 203nm， the flow rate was 1.0mL·min-1 and the column temperature was 45℃. Results The HPLC method can simultaneously evaluate the contents of Notoginsenoside R1， Ginsenoside Rg1 and Rb1 inRumohuoluo San. Notoginsenoside R1 showed a good linear relationship from 0.04268～0.4268mg/L， Ginsenoside Rg1 from 0.07564～0.7564mg/L and Ginsenoside Rb1 from 0.08672～0.8672mg/L（R>0.9994）. The average recovery of Notoginsenoside R1， Ginsenoside Rg1 and Rb1was 100.1%、99.78% and 101.4% respectively with RSD of 1.3 %～2.5% （n=9）. The stability test showed that the various indexes of 6 pilot test samples met the quality standard of Rumohuoluo San. Conclusion The established HPLC method is specific， accurate， reproducible and robust， whcih is suitable for the quality control of Rumohuoluo San. Rumohuoluo San is stable and controllable in quality.

Keywords：Rumohuoluo San；HPLC；Notoginsenoside R1；Ginsenoside Rg1；Ginsenoside Rb1

乳没活络散源于贵州省土家族民族处方，由三七、没药、乳香和制川乌等十味中药制成的散剂，具有活血化瘀、舒经活络、消肿止痛，促进骨折愈合功能，用于气滞血瘀型骨折、肿胀、瘀斑、肢节活动障碍等疾病，民间药用历史已有两百余年，临床疗效确切。贵州省思南田氏民族传统骨伤医院根据该验方开发了医疗机构制剂（批准文号：黔药制字Z20170134），该制剂已临床使用三十余年，疗效显着，深受患者欢迎。为有效控制乳没活络散的质量，本研究拟以乳没活络散中主药三七的人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1为特征性指标成分，建立乳没活络散的含量测定控制方法，并对乳没活络散的稳定性进行考察。

1 仪器与材料

1.1 仪器 ULmate3000高效液相色谱仪（美国Thermo公司），LC-20AD高效液相色谱仪（日本岛津公司）；TGL-16G高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；AE240十万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

1.2 材料 乳没活络散（批号：20160113、20160116、20160121、20170708、20170712、20170915，规格：20g/袋）；人参皂苷Rg1 对照品（批号：110703-201529）、人参皂苷Rb1对照品（批号：110704-201424）和三七皂苷R1对照品（批号：110745-201318）均购自中国药品生物制品鉴定所；乙腈（色谱纯，天津科密欧化学制剂有限公司），其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液的制备 分别称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1对照品10.67，18.91，21.68mg，置10mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得每1mL含三七皂苷R1 1.067g/L、人参皂苷Rg1 1.891g/L和人参皂苷Rb1 2.168g/L的混合对照品储备液。分别精密吸取混合对照品储备液0.2、0.4、0.8、1.6、2mL分别置5个5mL量瓶中，分别加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，制得三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1系列对照品工作液。

2.1.2 供试品溶液及缺三七药材阴性对照液的制备 取乳没活络散供试品1g，精密称定，置索式提取器中，加乙醚50mL，加热回流1h，放冷，弃去乙醚液，药渣挥干，加甲醇50mL，加热回流5h，放冷，提取液蒸至近干，残渣加氨试液10mL使溶解，移置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次20mL，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水20mL洗涤1次，分取正丁醇液，蒸至近干，残渣用适量50 %甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。另取按本品制备工艺制备的缺三七药材阴性制剂1g，精密称定，同法制备阴性对照液。

2.2 色谱条件及专属性考察 色谱柱：Inertsil ODS-3（4.6×250mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-水（B）梯度洗脱，洗脱程序（0～12min，19%A；12～32min，19%～30%A；32～40min，30%A；40～54min，30%～38%A；54～60min，38%A）；流速：1.0mL/min；柱温45℃；检测波长203nm。在该色谱条件下，各色谱峰与样品中其他组分色谱峰达基线分离，三七皂苷R1理论板数大于79000，如图1所示。

2.3 线性关系考察 分别精密吸取上述对照品系列工作液10μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，以峰面积Y为纵坐标，进样浓度（mg/L）为横坐标进行线性回归，分别计算线性回归方程，结果见表1。

2.4 精密度试验

2.4.1 重复性试验 精密称定取本品0.5，1，1.5g，照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密量取供试品溶液10μL进样测定，并计算平均含量。每个称量做3个平行。在取样为0.5～1.5g时，三七皂苷R1，平均含量为0.1054%，RSD为1.7%（n=9）；人参皂苷Rg1平均含量为0.5781%，RSD为1.9%（n=9）；人参皂苷Rb1平均含量为0.5234%，RSD为1.4%（n=9）。表明在称量0.5～1.5g范围内该方法重复性良好。

2.4.2 中间精密度 以不同的实验人员在不同时间按供试品溶液制备方法分别制备3份供试品溶液并测定。三七皂苷R1平均含量为0.1061%，RSD为1.6%（n=6）；人参皂苷Rg1平均含量为0.5788%，RSD为1.8%（n=6）；人参皂苷Rb1的平均含量为0.5202%之间，RSD为2.0%（n=6）。测定结果显示表示方法的中间精密度良好。

2.5 加样回收率 取已测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和含量的制剂（三七皂苷R1 0.1054%，人参皂苷Rg1 0.5781%，人参皂苷Rb1 0.5234%）0.5g，精密称定，每个称量平行3份，分别按所取样品量中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1质量数的50%、100%和150%的量精密加入对照品，照供试品溶液制备方法制备供试液，测定结果显示三种被测定化合物的回收率在99.78%～101.4%之间，RSD 在1.3 %～2.5%（n=9）之间，说明加样回收率良好。

2.6 耐用性试验 为考察所建立的分析方法耐用性，对供试品溶液的稳定性、不同色谱柱温、不同检测波长、不同流速、不同品牌色谱柱、不同品牌的仪器分别进行考察。

2.6.1 供试品溶液稳定性考察 取同一供试品，按供试品溶液制备方法制备供试液，分别于0、2、4、8、24h进样，结果人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1峰面积的RSD分别为0.62%～1.5%（n=5），表明供试品溶液在24h内稳定。

2.6.2 不同色谱柱分析结果比较 按拟定的色谱条件，用Inertsil ODS-3（4.6mm×250mm， 5μm）、Phenomonex C18（4.6mm×250mm， 4μm）和伊利特C18（5.0mm×200mm， 5μm）3种色谱柱对同一批号供试品进行测定。三七皂苷R1平均含量为0.1056%，RSD为2.2%（n=6）；人参皂苷Rg1平均含量为0.5784%（n=6），RSD为1.5%（n=6）；人参皂苷Rb1的平均含量为0.5233%，RSD为1.9%（n=6）。

2.6.3 不同流速测定结果比较 以Inertsil ODS-3（4.6mm×250mm， 5μm）色谱柱，以相同的流动相和洗脱梯度条件，分别按0.95、1.00和1.05mL/min不同流速的进行分析。三七皂苷R1平均含量为0.1079%，RSD为2.7%（n=9）；人参皂苷Rg1平均含量为0.5790%，RSD为1.0%（n=9）；人参皂苷Rb1的平均含量为0.5201%之间，RSD为2.3%（n=9）。结果表明三种流速测试的结果基本一致。

2.6.4 不同柱温测定结果比较 以Inertsil ODS-3（4.6mm×250mm， 5μm）色谱柱，按相同梯度和流速进行洗脱，分别33℃、35℃、和37℃进行分析。三七皂苷R1平均含量为0.1110%，RSD为2.2%（n=9）；人参皂苷Rg1平均含量为0.5790，RSD为1.7%（n=9）；人参皂苷Rb1的平均含量为0.5264%，RSD为1.0%～2.6%（n=9）。

2.6.5 不同检测波长测定结果比较 以Inertsil ODS-3（4.6mm×250mm， 5μm）色谱柱，分别以201nm、203nm和205nm进行检测，其余色谱条件不变进行测定。三七皂苷R1平均含量为0.1107%，RSD为1.7%（n=9）；人参皂苷Rg1平均含量为0.5974%，RSD为2.0%（n=9）；人参皂苷Rb1的平均含量为0.5285%之间，RSD为2.3%（n=9）。结果表明波长的小幅变动对测定结果基本不影响。

2.6.6 不同型号仪器分析结果比较 按拟定的色谱条件，采用Inertsil ODS-3（4.6mm×250mm， 5μm）色谱柱，以Thermo ULmate3000和岛津 LC-20AD高效液相色谱仪对同一批号供试品进行测定，结果三七皂苷R1平均含量为0.1092%，RSD为1.7%（n=6）；人参皂苷Rg1平均含量为0.5790%，RSD为1.3%（n=6）；人参皂苷Rb1的平均含量为0.5248%，RSD为2.3%（n=6）。

2.6.7 制剂中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量测定 取三批次乳没活络散，按照本方法进行样品处理和成分测定，结果见表2。

2. 7 乳没活络散稳定性研究

2.7.1 加速稳定性考察 取模拟医院制剂包装样品（20160113、20160116和20160121批次），置温度（40±2）℃，相对湿度75%±5%，分别于0、1、2、3、6月取样进行检测。测定结果表明，本品所测三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量。试验结果表明，经过6个月加速试验考察，制剂中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量没有明显变化，分别为0.1075%～0.1119%、0.5567%～0.5661%和0.5012%～0.5148%，符合质量标准要求。

2.7.2 长期稳定性考察 取模拟医院制剂包装样品，室温贮藏24个月。分别于0、3、6、9、12、18、24月取样进行检测。测定结果表明，本品所测三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量。试验结果表明，经室温留样长期试验24个月，制剂中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量没有明显变化，分别为0.1055%～0.1108%、0.5517%～0.5613%和 0.4981%～0.5118%，符合质量标准要求。

3 讨论

乳没活络散由十味药材组成，直接采用甲醇提取正丁醇萃取方法制备得到的供试品溶液杂质多，干扰严重，被测成分分离度达不到要求，同时，对色谱柱污染严重，因此需要进一步净化样品。根据皂苷类化合物理化性质，先采用乙醚去除制剂中的脂溶性成分，再用甲醇提取制剂三七中皂苷类化合物，将甲醇提取液蒸至近干后，残渣用氨试液溶解，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取皂苷类成分，除去酚酸类酸性成分，所得的供试品溶液进样分析时被测成分分离良好，杂质不干扰测定。

目前测定三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量的方法多采用高效液相色谱法梯度洗脱[1-8]，选用紫外检测器[1-5]、蒸发光检测器[6-8]进行测定。也有用超高效液相色谱法[9]测定其含量，但该法对仪器要求比较高，设备较昂贵，不易普及。本研究参考文献报道[1-5]，在《中国药典》[10]方法的基础上针对本方进行了不同色谱柱、不同流速等条件的改良测定，建立了从供试品制备到样品检测的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量测定方法。结果证明该法具有样品处理简单、专属性强、灵敏度高，重复性好等特点，可以作为乳没活络散的质量控制方法。在乳没活络散稳定性试验中，除三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量测定外，还分对外观性状、鉴别、各项检查及微生物等指标进行了考察，结果均符合质量标准要求，说明本品在24 个月内质量稳定，直接接触药品的包装对药品质量无影响，故乳没活络散的有效期暂定为24 个月。

参考文献

[1]李冬云，李霞莉.血尿康胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷 Rb1含量测定[J].中国药业，2015，24（12）：66-67.

[2]杨辉，劳广耀，唐德智.HPLC法测定复方黄根颗粒中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1含量[J].中国药师，2015，18（1）：55-57.

[3]黄玉英.HPLC法同时测定三七伤药胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1含量[J].中国药房，2015，26（12）：1706-1708.

[4]辛爱玲，邢向伟.RP-HPLC 法测定三七丹胶囊中人参皂苷 Rb1、人参皂苷 Rg1、三七皂苷 R1的含量[J].北方药学，2014，11（3）：2-3.

[5]李铭. HPLC法测定葆宫止血颗粒中三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Rb1的含量[J]. 中国当代医药， 2017， 24（4）：16-19.

[6]彭金香， 吴沣， 黄华斌，等. HPLC-ELSD法同时测定心灵丸中六种皂苷类成分的含量[J]. 中国药师， 2017， 20（6）：1133-1135.

[7]郭汉文，沙东旭.HPLC- ELSD法测定人参茎叶皂苷胶囊中人参皂苷Rg1、Re的含量[J].中国药师，2013，16（4） ： 546-548.

[8]毕晓黎，罗文汇，李素梅.HPLC-ELSD 法测定三七止血胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量.中国实验方剂学杂志，2011，17（1） ： 75-77.

[9]许勇，诸艳蓉，王柯，等.HPLC测定复方丹参胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（6）：148-151.

[10]国家药典委员会. 中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015.

（收稿日期：2018-06-19 编辑：程鹏飞）