吴经耀 冯瑛
【摘 要】 目的：测定并比较不同采收期两年生长期的铁皮石斛中多糖含量、甘露糖含量、甘露糖与葡萄糖峰面积比及乙醇浸出物含量，寻找铁皮石斛的最佳采收期。方法：
用紫外分光光度法进行多糖含量测定，高效液相法测定甘露糖、甘露糖与葡萄糖面积比，热浸法测定乙醇浸出物。结果：按照干燥品计，头年10月、次年3月采收的铁皮石斛中多糖含量（%）分别为（31.6±2.8）、（38.3±2.7），两组之间比较差异有统计学意义（P<0.05）;甘露糖含量（%）分别为（32.3±3.6）、（35.0±3.5），两组之间比较差异无统计学意义（P>0.05）;甘露糖与葡萄糖峰面积比为（3.2±0.7）、（2.0±0.6），两组之间比较差异有统计学意义（P<0.05）;乙醇浸出物含量（%）分别为（12.6±1.8）、（6.4±1.7），两组之间比较差异有统计学意义（P<0.05）;铁皮石斛多糖含量增加，甘露糖与葡萄糖峰面积比呈现递减趋势，乙醇浸出物含量呈现递减趋势。结论：铁皮石斛头年10月到翌年3月多糖含量最高，为最佳采收期。如中药生产上需要以铁皮石斛多糖为主要有效成分，两年生的铁皮石斛药材采收时间为次年3月更科学合理。
【关键词】 铁皮石斛;多糖;甘露糖;甘露糖与葡萄糖峰面积比;乙醇浸出物
【中图分类号】R282.6 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2019）10-0039-04
The Determination and Comparison of Main Components of Dendrobium officinale in Different Harvesting Periods
WU Jingyao FENG Ying
Institute of Traditional Chinese Medicine of Zhejiang province Co.Limited，Hangzhou 310023，China
Abstract：Objective To determine and compare the content of polysaccharide， mannose， peak area ratio of mannose and glucose and the content of ethanol extract in dendrobium candidum with different harvesting periods，to search for the best harvest period of dendrobium officinale.Methods The content of polysaccharide was determined by uv spectrophotometry， the area ratio of mannose， mannose and glucose was determined by HPLC， and the ethanol extract was determined by hot dip method. Results The polysaccharide content （%） of dendrobium officinalis collected in October of the first year and March of the next year were （31.6±2.8 ） and （38.3±2.7 ）， respectively. The mannose content （%） was （32.3±3.6 ） and （35.0±3.5 ）， respectively. There was no significant difference between the two groups. The peak area ratio of mannose to glucose was （3.2±0.7 ）， （2.0±0.6 ）， and there was a significant difference between the two groups. The content of ethanol extract （%） was （12.6±1.8 ） and （6.4±1.7 ）， respectively. The content of polysaccharide in dendrobium officinale increased， the peak area ratio of mannose and glucose decreased， and the content of ethanol extract decreased. Conclusion The content of polysaccharide in dendrobium officinale was the highest from October of the first year to March of the next year. If the polysaccharide of dendrobium candidum is the main active ingredient in the production of traditional Chinese medicine， the harvest time of the biennial dendrobium candidum in the following March should be more scientific and reasonable.
Key words： Dendrobium officinale; Polysaccharides; Mannose; The Ratio of the Sugar to the Glucose Peak; Ethanol Extract
铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为石斛之极品，因其表皮呈铁绿色而得名。铁皮石斛具有独特的药用价值，被誉为“九大仙草”之首，《神农本草经》曰“主伤中、除痹、下气、补五脏虚劳羸瘦、强阴、久服厚肠胃”，现代研究表明铁皮石斛的茎能够益胃生津，滋阴清热，对治疗口干烦躁、食少干呕、阴虚火旺有很好的疗效。文献报道[1]对铁皮石斛药材的质量标准及最佳采收期进行研究，但其以总水溶性糖及总水溶性多糖含量为分析指标，发现11～3月期间含量较高，开花期4～5月明显下降，随后又开始回升，并且未参照最新版《中国药典》进一步对头年11月份到次年3月份的差异开展研究，故本实验在2015版《中华人民共和国药典》指导下，测定了浙江某种植基地头年11月份到次年3月份不同采收时间两年生铁皮石斛中的多糖含量、甘露糖含量、甘露糖与葡萄糖峰面积比及乙醇浸出物含量，从而为铁皮石斛最佳采收期和药材质量控制提供了一定的参考依据。
1 仪器与材料
1.1 药品与试剂 铁皮石斛样品采自浙江某种植基地，取自生长期为两年的铁皮石斛的干燥茎，经过浙江省中药研究所教授级高工王志安鉴定为铁皮石斛药材，样品干燥粉碎过三号筛。采收期分别为：浙1号到浙6号（2014年10月），浙7号到浙12号（2014年12月），浙13号到浙18号（2015年3月），浙19号到浙24号（2015年5月），浙25号到浙30号（2015年7月）。D-无水葡萄糖标准品（批号：110833-201205，中国食品药品检研究院，含量99.5%）。5%苯酚溶液：称取苯酚（分析纯，批号：20141108，兰溪市六洞山化工试剂厂）2.5g，加纯水50mL，摇匀即得（临用配制）。硫酸（分析纯，批号：20141108，杭州双林化工试剂厂），95%乙醇（批号：20150104，杭州化学试剂有限公司）。
1.2 仪器 Lambda 20紫外/可见分光光度计（美国PERKIN ELMER公司），METTLER TOLEDOAB204-S电子天平（瑞士METTLER公司），TC-15套式恒温锅（浙江海宁新华医疗器械厂），Agilent 1260高效液相色谱仪，Agilent 20RBAX SB-C18色谱柱。
2 方法
2.1 多糖含量测定
2.1.1 供试品溶液的制备 取本品粉末约0.3g，加水200mL，加热回流2h，放冷，转移至250mL量瓶中，用少量水分次洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2mL，置15mL离心管中，精密加入无水乙醇10mL，摇匀，冷藏1h，取出，离心（转速为每分钟4000转）30min，弃去上清液（必要时滤过），沉淀加80%乙醇洗涤2次，每次8mL，离心，弃去上清液，沉淀加热水溶解，转移至25mL量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，即得。
2.1.2 标准曲线制备 精密量取对照品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分别置10mL具塞试管中，各加水补至1.0mL，精密加入5%苯酚溶液1mL（临用配制），摇匀，再精密加硫酸5mL，摇匀，置沸水浴中加热20min，取出，置冰浴中冷却5min，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法（通则0401），在488nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2.1.3 测定法 精密量取供试品溶液1mL，置10mL具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液1mL起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的量，计算，即得[1]。
2.2 甘露糖含量测定
2.2.1 甘露糖色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-0.02mol/L乙酸铵溶液（20∶80）为流动相;检测波长为250nm。理论板数按甘露糖峰计算应不低于4000。
2.2.2 校正因子测定 取盐酸氨基葡萄糖适量，精密称定，加水制成每1mL含12mg的溶液，作为内标溶液。另取甘露糖对照品约10mg，精密称定，置100mL量瓶中，精密加入内标溶液1mL，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，吸取400μL，加0.5mol/L的PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）甲醇溶液与0.3mol/L氢氧化钠溶液各400μL，混匀，70℃水浴反应100min。再加0.3mol/L的盐酸溶液500μL，混匀，用三氯甲烷洗涤3次，每次2mL，弃去三氯甲烷液，水层离心后，取上清液10μL，注入液相色谱仪，测定，计算校正因子。
2.2.3 测定法 取本品粉末（过三号筛）约0.12g，精密称定，置索氏提取器中，加80%乙醇适量，加热回流提取4h，弃去乙醇液，药渣挥干乙醇，滤纸筒拆开置于烧杯中，加水100mL，再精密加入内标溶液2mL，煎煮1h并时时搅拌，放冷，加水补至约100mL，混匀，离心，吸取上清液1mL，置顶空瓶中，加3.0mol/L的盐酸溶液0.5mL，封口，混匀，110℃水解1h，放冷，用3.0mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至中性，吸取400μL，照校正因子测定法，自“加0.5mol/L的PMP甲醇溶液”起，依法操作，取上清液10μL，注入液相色谱仪，测定，即得[1]。
2.3 甘露糖与葡萄糖峰面积比 取葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每1mL含50μg的溶液，作为对照品溶液。精密吸取0.4mL，按照2015版《中国药典》一部铁皮石斛项下含量测定甘露糖项下方法依法测定。
2.4 浸出物 按照2015版《中国药典》通则2201的热浸法测定，用乙醇作溶剂。2.1～2.4结果见表1和表2。
2.5 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异具有高度统计学意义。
3 结果
3.1 不同采收期铁皮石斛茎的主要成分含量 见表1。
2.2 不同采收期铁皮石斛茎主要成分含量的统计学处理结果见表2。
4 讨论
根据2015版《中国药典》一部[2]：供试品溶液的制备流程其中一部分为“（转速为每分钟4000转）离心20min，弃去上清液（必要时滤过）”，此处值得商榷。因为离心后容易出现白色沉淀，有一部分粘附离心管壁上，还有少量很淡的白色沉淀在上清液里，倾倒上清液时容易损失，造成多糖含量偏低，如果改为“（转速为每分钟4000转）离心30min，上清液滤过，用少量热水洗涤滤纸数次，合并滤液”，这样较为妥当。原因是离心时间延长，可以把白色沉淀最大限度附着在离心管壁上，过滤可以保证很淡的白色沉淀得以留在滤纸上，最大限度减少不同采收时间多糖含量的差异。
比较表1和表2中采收期（2014.10与2015.3）的铁皮石斛，多糖含量增加，乙醇浸出物含量呈现递减趋势。一般情况乙醇浸出物是指用95%的乙醇采用热浸法提取制得。高浓度的乙醇提取出的成分主要是脂溶性成分为主，而多糖易溶于热水属于水溶性成分。药材多糖含量增加，意味着脂溶性成分占比下降，所以乙醇浸出物含量呈现递减趋势。药材多糖含量增加，甘露糖与葡萄糖峰面积比呈现递减趋势可能原因是多糖含量增加，葡萄糖峰面积呈现出上升趋势，甘露糖与葡萄糖峰面积比中的分母增加，所以两者的面积比呈现下降趋势。根据实验结果，铁皮石斛头年10月到翌年3月多糖含量最高，这段时间为最佳采收期。此外铁皮石斛（2015.3采收）比铁皮石斛（2014.10采收）多糖含量高，从另一方面证实了本文结论如果中药生产过程中，以铁皮石斛多糖为主要有效成分，次年3月采收铁皮石斛比头年10月采收要更科学合理，符合石斛生长过程中多糖含量变化的规律[3-15]。铁皮石斛每年4～5月份为开花期，多糖含量明显下降后又开始回升，最佳生长期和最佳采收期基本符合。本研究可以为企业的石斛种植和采收提供了可靠的科学依据。
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