康绍建 赵琪钟 侯安国
【摘 要】 目的：提高克淋通胶囊的质量标准，便于控制其质量。方法：采用薄层色谱法（TLC）法鉴别黄柏，并检查关黄柏;采用高相液相色谱法（HPLC）法测定克淋通胶囊中没食子酸的含量。结果：TLC方法斑点清晰，专属性强;HPLC法测定没食子酸在0.04242～0.6363μg范围内线性关系良好，平均加样回收率为99.76%，RSD值0.25%。结论：该方法操作简便、结果准确可靠、专属性及重现性好，可用于有效地控制克淋通胶囊的质量。
【关键词】 TLC;HPLC;克淋通胶囊;没食子酸;含量测定
【中图分类号】P284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2021）24-0031-04
Promotion on Quality Standard of Kelintong Capsules
KANG Shaojian1 ZHAO Qizhong2 HOU Anguo3*
1. Center for Food And Drug Inspection of Yunnan Province，Kunming 650011，China;2.Puer Center for Drug
Control，Puer 665000，China;3.Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China
Abstract：Objective To improve the quality standards of Kelintong Capsules in order to conveniently and effectively control its internal quality. Methods The TLC method was used to identify Phellodendron amurense and check Guan Phellodendron，and the content of gallic acid in Kelintong capsules was determined by HPLC. Results The TLC method has clear spots and strong specificity. The linear relationship of gallic acid measured by HPLC in the range of 0.04242～0.6363 μg is good. The average recovery rate is 99.76% and RSD=0.25%.Conclusion This method is easy to operate，accurate and reliable，specific and reproducible，and can be used to effectively control the quality of Kelintong capsules.
Key words：TLC; HPLC; Kelintong Capsules; Gallic Acid; Content Determination
泌尿系统感染通常指肾脏、输尿管、膀胱、尿道各个部位感染的总称，严重威胁人类健康[1-2]，尿路感染是继呼吸系统及消化道之后的第三位感染性疾病。克淋通胶囊由头花蓼（四季红）、黄柏等二味药制成，具有清热解毒、利湿通淋作用，临床上常用于治疗泌尿系统感染。对头花蓼的药理研究[3-4]表明，其对泌尿系统感染有抗菌作用，盐酸小檗碱和盐酸巴马汀是黄柏的主要化学成分，其盐酸小檗碱具有抑制炎症反应[5-8]、抗病原微生物的作用[9-11]，巴马汀也具有抗炎作用[12-13]，这些作用皆与克淋通胶囊用药功效一致。克淋通胶囊原标准[标准号：WS-11282-（ZD-1282）-2002]中仅有头花蓼的薄层鉴别和盐酸小檗碱的HPLC法含量测定，故为了更好地控制此胶囊剂的质量，对其质量标准进行提升研究，本试验在克淋通胶囊原标准中增加了黄柏和关黄柏的薄层鉴别，同时采用HPLC法建立了头花蓼（四季红）中没食子酸的含量测定方法[14-20]，为克淋通胶囊的质量控制提供科学依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器 The Shimadzu LC-20AT高效液相色谱仪;PM4-1300TL超声仪;UV-2550紫外可见分光光度计;Sartorius CPA225D电子分析天平（十万分之一）;Sartorius BS224S电子分析天平（万分之一）。
1.2 试药 克淋通胶囊由贵州联盛药业有限公司提供（批号1402100、1402110、1402120、1402130、1402150）。没食子酸对照品（110831-201605）（含量以90.8%计）;关黄柏对照药材（批号：120937-201408）;黄柏对照药材（批号：121510-201606）;盐酸小檗碱对照品（批号：110713-201814）;盐酸巴马汀对照品（批号：110732-201913）均由中国食品药品检定研究院提供。实验用甲醇、乙腈为色谱纯、由美国默克公司生产;水为纯净水;甲醇、磷酸等其它试剂均为分析纯。硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂分厂、默克股份两合公司）。
2 方法与结果
2.1 黄柏薄层鉴别 称取供试品粉末0.2 g，加盐酸-甲醇（1∶100）溶液25 mL，超声处理15 min，滤过，滤液作为供试品溶液。另取黄柏对照药材0.1 g，按上述方法制成对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品适量，加盐酸-甲醇混合溶液（1∶100）制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典通则0502 ）试验，吸取上述对照药材溶液、对照品溶液及供试品溶液各1～3 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯—乙酸乙酯—甲醇-异丙醇-水（6∶3∶2∶1.5∶0.3）为展开剂，点板展开，晾干后，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果表明，供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点。结果如图1所示。
2.2 关黄柏薄层鉴别 精密称取供试品粉末0.1 g，加甲醇10 mL，加热回流15 min，滤过，滤液作为供试品溶液。另取关黄柏对照药材0.1 g，按上述方法制成对照药材溶液。再取盐酸巴马汀对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。吸取关黄柏供试品溶液1～2 μL，对照品溶液、对照药材溶液各1 μL，分别点于同一硅胶G板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）为展开剂，点板展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果表明，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，无相同颜色的荧光斑点出现。结果如图2所示。
2.3 含量测定（头花蓼）
2.3.1 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;甲醇-0.1%磷酸（5∶95）为流动相;流速为1.0 mL·min-1，柱温为30 ℃，检测波长为216 nm，进样体积 10 μL。理论板数按没食子酸峰计，应不低于2500。
取适量的没食子酸对照品，以50%甲醇溶液稀释，紫外-可见分光光度计选择在200～400 nm波长范围进行光谱扫描，根据其光谱图，没食子酸对照品最大吸收波长为216 nm，因此该方法检测波长确定为216 nm。
2.3.2 对照品溶液 精密称取没食子酸对照品11.68 mg，至50 mL棕色容量瓶中，加50% 甲醇溶液溶解并稀释至刻度。精密吸取5～50 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇溶液稀释至刻度，即得对照品溶液。
2.3.3 供试品溶液 精密称取取本品内容物0.2 g，置具塞锥形瓶内，精密移取50%甲醇溶液50 mL，称定重量，超声处理15 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.3.4 阴性样品溶液 根据处方制备不含头花蓼的阴性样品，按“2.3.3”项下方法制备阴性样品溶液，即得。
2.3.5 专属性试验 依据“2.3.1”项下色谱条件，分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液及阴性样品溶液各10 μL，测定。结果表明，在与对照品溶液色谱图相应保留时间处，供试品溶液有没食子酸特征吸收峰，而阴性对照液无相应吸收峰，表明专属性良好。如图3～5所示。
2.3.6 线性关系的考察 精密吸取没食子酸对照品溶液（0.02121 mg/mL）2、5、10、15、20、30 μL进样，记录高相液相色谱，以没食子酸峰面积为横坐标，以进样量（μg）为纵坐标作图，得回归方程为：Y=0.0001X-0.0002（r2=1），没食子酸在0.04242～0.6363 μg之间线性关系良好。
2.3.7 精密度试验 精密吸取没食子酸对照品溶液（0.02121 mg/mL）10 μL，连续进样6次，测定没食子酸峰面积，结果峰面积RSD=0.59%，说明仪器精密度良好。
2.3.8 重复性考察 取同一批号（批号：1402100）样品6份，按上述“2.3”项下供试品溶液制备方法，平行处理并测定，结果6 次测得没食子酸平均含量为2.8558 mg/g，RSD=1.25%;表明重复性良好。
2.3.9 稳定性考察 按上述“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，室温条件下每2小时进样1次，以峰面积计算， RSD为1.48%（n=7）;结果表明室温条件下，供试品溶液中芍药苷在12 h内稳定性较好。
2.3.10 准确度考察 精密称取6份已知浓度（2.8558 mg/g）供试品（批号1402100）各0.1 g，装入具塞锥形瓶中，各自精密加入没食子酸对照品溶液（浓度0.01818 mg/mL）15 mL，按上述“2.3.3”项下方法制备所需溶液，照含量测定方法项下操作，测定供试品溶液中没食子酸的含量，计算没食子酸的平均回收率为99.76%，RSD为0.25%。上述结果表明该方法准确度良好。见表1。
2.3.11 含量测定 按上述色谱条件，依法测定5批样品中没食子酸的含量。结果如下表2。
3 讨论
本试验采用TLC法对克淋通胶囊中黄柏和关黄柏进行了定性鉴别，其结果分离度好，专属性强。同时通过HPLC法建立了克淋通胶囊头花蓼（四季红）中没食子酸的含量测定方法，经过HPLC方法学考察以及对5批克淋通胶囊样品进行含量测定，结果表明本方法准确，专属性强，可作为克淋通胶囊头花蓼（四季红）中没食子酸的含量测定方法[21-22]。
3.1 提取溶剂的选择 采用稀乙醇，30%甲醇，50%甲醇为提取溶剂，试验结果表明，当提取溶剂为50%甲醇时，提取效果最好，故选用50%甲醇。
3.2 提取方法的选择 预实验通过对50%甲醇超声提取30 min、加热回流提取30 min、索氏提取2 h及3 h比较，其中索氏提取2 h所得含量最低，索氏提取3 h所得含量接近超声提取30 min和加热回流提取30 min;超声提取效果较好且简便快捷，故选用超声提取方法。
3.3 提取时间的选择 实验通过对50%甲醇超声提取10 min 、15 min、30 min比较，实验表明超声提取15 min和超声提取30 min所得含量测定值接近;故选用超声提取15 min。
3.4 流动相的选择 预实验时分别以乙腈-甲酸、乙腈-水，甲醇-0.1%磷酸水溶液作为流动相进行考察，结果表明，甲醇-0.1%磷酸水溶液为流动相时，所得色谱图峰形好，分离效果好。故本研究选择甲醇-0.1%磷酸水溶液为流动相。
3.5 柱温的选择 预实验分别以20、25、30 ℃为柱温进行考察。为减少时间且分离效果较好，故本研究柱温选择30 ℃。
综上所述，在克淋通胶囊现行质量标准的基础上增加了黄柏和关黄柏的薄层鉴别方法及有效成分指标没食子酸的含量测定，方法简单易行，为完善和提高克淋通胶囊的质量标准提供了科学依据。
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（收稿日期：2021-04-28 编辑：陶希睿）
