王升勇 潘章超 邢英华 王勇
【摘 要】 目的：初步建立黎药弯柄灵芝的质量标准。方法：对弯柄灵芝药材的性状进行鉴定，对其显微特征进行鉴别；参照《中国药典》2020年版方法，采用薄层色谱法（TLC）对药材进行定性鉴别，采用分光光度法测定药材中的多糖和三萜及甾醇含量。结果：明确了弯柄灵芝的性状及显微特征，建立了专属的TLC定性鉴别法；初步规定了弯柄灵芝多糖含量不得低于0.80%，三萜及甾醇含量不得低于0.90%。结论：本研究建立的弯柄灵芝药材质量标准可为其质量控制及资源可持续利用提供依据。
【关键词】 黎药；弯柄灵芝；质量标准；显微鉴别；薄层色谱
【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2024）10-0050-05
DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.10.zgmzmjyyzz202410011
A Preliminary Study on the Quality Control of Ganoderma flexipes
WANG Shengyong1 PAN Zhangchao2 XING Yinghua1 WANG Yong2*
1. Hainan Health Vocational College， Haikou 570311， China;
2. School of Pharmacy， Hainan Medical University， Haikou 571199，China
Abstract：Objective To establish the quality standard of Ganoderma flexipes.Methods The macroscopic and microscopic characteristics of Ganoderma flexipeswere identified.The qualitative identification of the medicinal materials was performed by thin layer chromatography （TLC）. The contents of polysaccharides， triterpenoids and sterols in the samples were determined according to the method of Chinese Pharmacopoeia （2020 edition）.Results This study clarified the characteristics and microscopic characteristics of Ganoderma flexipes， and established an exclusive TLC qualitative identification method.The content of polysaccharide in the samples should not be less than 0.80%， and the content of triterpene and sterol should not be less than 0.90%.Conclusion These results provide a reference for establishing a standard quality system， resource development and utilization for Ganoderma flexipes.
Key words：Li Medicine; Ganoderma flexipes;Quality Standard; Microscopical Identification; Thin Layer Chromatography （TLC）
灵芝属真菌Ganoderma P.Karst.隶属担子菌门Basidiomycota、蘑菇纲Agaricomycetes、多孔菌目Polyporales、灵芝科Ganodermataceae，是一类大型可食用真菌［1］。灵芝被认为是一种药用菌已有2000多年的历史，始载于东汉时期的《神农本草经》，被认为是滋补强壮、扶正固本的珍贵中药，列为上品［2］。《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）规定，灵芝为多孔菌科真菌赤芝 Ganoderma lucidum （Leyss．exFr．）Karst.或紫芝 Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang 的干燥子实体［3］。灵芝含有约400种不同的生物活性化合物，主要包括三萜、多糖、核苷酸、甾醇、类固醇、脂肪酸和蛋白质等［4-5］。现代药理研究［6-14］表明，灵芝具有抗肿瘤、抗氧化剂、抗菌、抗癌、免疫调节、抗炎、降血糖等作用，因此在医药、保健等领域具有广泛的应用前景。
弯柄灵芝（Ganoderma flexipes）为灵芝属真菌，在我国广泛分布于广东、广西、海南、云南西双版纳、福建等地，是热带雨林区域的主要灵芝品种之一，是海南稀有的、特色的、优质的、广泛使用的药用真菌资源［15］。在黎族地区应用较多，但目前对弯柄灵芝的研究较少。已有的研究主要是针对弯柄灵芝的多糖、三萜等化学成分以及资源分布等情况。研究［15］发现，弯柄灵芝中含有大量的有效成分，且相对含量优于常规赤芝。对弯柄灵芝的三萜成分研究发现灵芝酮A （ganoderone A）和灵芝醇B （ganoderol B）的含量占三萜分离量的80%以上。陈德力等［15］采用加速溶剂提取工艺提取了弯柄灵芝中的总三萜，所得总三萜对DPPH自由基的IC50值为273.4 μg/mL，结果表明有较强自由基清除作用。另有研究［16］对一株野生的弯柄灵芝进行了鉴定，分别采用水提醇沉法和乙醇提取法获得了多糖和三萜，两者含量分别为23.70 mg/g和9.67 mg/g。多糖和三萜被认为是灵芝中起主要药理作用的两类化合物。目前，尚未发现关于弯柄灵芝药材及这两类化合物质量标准方面的研究报道，且现行《中国药典》也未收载弯柄灵芝。
为控制弯柄灵芝药材的质量，本研究通过药材性状、显微特征、薄层色谱鉴别、多糖含量、三萜与甾醇含量等质量指标进行了研究，为其质量控制及资源开发利用提供参考。
1 材料与仪器
1.1 材料与试剂 3批弯柄灵芝先后采自海南省五指山市，经海南医学院药学院曾念开教授鉴定为灵芝科灵芝属真菌Ganoderma flexipes 的干燥子实体；石油醚（60～90℃，西陇科学股份有限公司，批号：B2212191）；乙酸乙酯（广西光华科技股份有限公司，批号：20200327）；甲酸（洛阳市化学试剂厂，批号：15896-1995）；齐墩果酸（中国药品生物制品鉴定所，批号：110709-200304）；香草醛（广州化学试剂厂，批号：020901-3）；弯柄灵芝对照药材（四川省维克奇生物科技有限公司，批号：ycwkq23041407）；氢氧化钾、高氯酸；苯酚、硫酸、高氯酸、甲醇、乙醇（分析纯，西陇科学股份有限公司）。
1.2 仪器与设备 HH-4数显恒温水浴锅（金坛市亿能实验仪器厂）；PX224ZH/E电子天平［奥豪斯仪器（常州）有限公司］；ZF-20D暗箱式紫外分析仪（巩义市瑞德仪器设备有限公司）；JASCO V-650紫外分光光度计［佳司科（上海）贸易有限公司］；CKK53倒置生物显微镜［奥林巴斯工业有限公司（广州）］；LYSF-200-B超高速多功能粉碎机（长沙市卓成医疗器械有限公司）。
2 方法
2.1 性状鉴别 参照2020版《中国药典》 （四部）通则0212项下的检定方法对弯柄灵芝的形状、大小、表面色泽和特征、质地、断面及气味进行观察和描述。
2.2 显微鉴别 取弯柄灵芝粉末少许置于载玻片上，滴加5%氢氧化钾透化，加盖玻片，置于生物显微镜下观察弯柄灵芝菌丝结构并拍照记录。取弯柄灵芝菌盖粉末，同法操作，观察孢子结构并拍照记录。
2.3 薄层色谱鉴别 参照2020版《中国药典》（一部）［3］灵芝项下的“鉴别”，并对方法进行调整。分别称取3批弯柄灵芝粉末2 g，加乙醇30 mL，加热回流30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL溶解，作为供试品溶液。取弯柄灵芝对照药材0.5 g，等比例加如适当溶剂，同法制成对照药材溶液。吸取上述两种溶液各4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸（15∶[KG-*3/5]4∶[KG-*3/5]1，V/V/V）展开，取岀，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点。
2.4 多糖含量测定 参照2020版《中国药典》（一部）［3］灵芝含量测定项下“多糖”方法制备对照品溶液：精密称定葡萄糖对照品0.012 g，加水定容至10 mL，制成每1 mL含0.12 mg 的溶液，即得多糖对照品溶液。
标准曲线的建立：采用李靖［18］的方法并稍作修改。精密量取对照品溶液 0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL分别置 10 mL具塞试管中，各加水至2.0 mL，加5%苯酚试液1 mL，迅速加入5 mL浓硫酸，振荡混匀静置10 min，再于100℃水浴加热15 min，在冰水浴中迅速冷却至室温，取出，以相应的试剂为空白，在 490 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，质量为横坐标，绘制标准曲线。供试品溶液的制备，参照2020版《中国药典》（一部）［3］。
多糖含量测定：精密移取供试品溶液2 mL，自“加苯酚试液1 mL”，同法操作，在 490 nm 波长处测定吸光度，平行实验3次以减小误差。将测得的吸光度值代入标准曲线即可求得。
2.5 三萜及甾醇测定方法 参考参照《中国药典》2020 版（一部）灵芝含量测定测定项下“三萜与甾醇”，采用香草醛－冰醋酸法测定三萜含量［3］。
3 结果与分析
3.1 性状鉴别 菌盖近圆形、半圆形或肾形，1.2～3.7cm×1.0～2.1 cm，厚0.2～1.1 cm，表面有光泽，呈红褐色，条纹明显，呈放射状，有显着的同心环沟，不平整；菌柄弯曲不规则，长7.5～20.9 cm，直径0.2～0.9 cm，呈红褐色至紫黑色，上部无褶皱表面光滑，底部粗糙；质地坚硬，不易折断；菌肉呈深木材色到淡褐色，无明显分层，厚0.2～0.5 cm；有明显的类似灵芝样的木质清香味。如图1所示。
3.2 显微鉴别 弯柄灵芝粉末呈浅棕色、棕褐色；菌丝散在或粘结呈团状，无色至浅白色，细长，不规则弯曲，分支较少；可见少量孢子，呈椭圆形，分散不均，6.3～9.1 μm×6.3～8.1 μm。如图2所示。
3.3 薄层色谱鉴别 如图3所示，在供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置，在365 nm紫外灯下显示相同颜色的荧光斑点。
3.4 多糖含量测定 以葡萄糖质量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，拟合曲线为Y=8.1226X + 0.0195，R2=0.9997。3批弯柄灵芝多糖含量测定结果见表1。3批弯柄灵芝多糖平均含量为1.02%，第三批的含量最高，其次是第一批，含量最低的是第二批，但三批弯柄灵芝多糖含量相差不大，质量分数范围为0.97%～1.08%。
3.5 三萜及甾醇含量测定 采用香草醛—冰醋酸法绘制的标准曲线为Y=73.525X－0.0781，R2=0.9994。3批弯柄灵芝三萜及甾醇含量测定结果见表1。质量分数范围为1.25%～1.31%，其中，第二批含量最高（1.31%），三批样品中三萜及甾醇平均含量为1.23%。
4 讨论
4.1 TLC法的建立 2020版《中国药典》收载了灵芝的薄层色谱法，但在实验过程中发现采用该方法中的色谱条件，弯柄灵芝斑点分离效果较差且存在拖尾现象。因此调整了展开剂及其比例。在实验中，使用乙酸乙酯代替甲酸乙酯后，置紫外光灯（365 nm）下检视，结果斑点分离效果更好。为了获得更好的分离效果，通过调整展开剂比例后，发现荧光斑点显绿色、斑点清晰易见、分离效果及重现性均较好。因此，最终确定展开剂为石油醚-乙酸乙酯-甲酸（15∶[KG-*3/5]4∶[KG-*3/5]1，V/V/V）。
4.2 多糖和三萜及甾醇限度确定 考察了三批弯柄灵芝中多糖和三萜及甾醇含量。多糖和三萜均为灵芝的主要活性成分，因此确定两者的限度对弯柄灵芝药材的质量控制至关重要。
参照2020版《中国药典》“灵芝”项下的多糖，采用苯酚—硫酸显色法测定其含量。3批弯柄灵芝多糖含量范围为0.97%～1.08%，与郑雷舒等［19］在无柄灵芝质量标准研究中的20批无柄灵芝多糖含量相当。将3批弯柄灵芝多糖含量测定平均值按80%计算得到含量标准为0.82%，拟规定弯柄灵芝多糖含量为：本品按干燥品计算，含多糖以无水葡萄糖（C6H12O6）计，不得少于0.80%。
参照2020版《中国药典》“灵芝”项下的三萜及甾醇测定法测定其含量。3批弯柄灵芝三萜及甾醇含量范围在1.25%～1.31%。郑雷舒等［19］在无柄灵芝质量标准研究中的20批无柄灵芝三萜及甾醇平均含量分为0.59%～0.75%和0.59%～0.75%。本研究弯柄灵芝的三萜及甾醇含量显着高于无柄灵芝。另外，与赵丽丽［16］等人研究的一株野生弯柄灵芝中三萜及甾醇含量相比较，本研究中的含量略高。将3 批弯柄灵芝三萜及甾醇含量测定平均值乘以80%，得到含量标准为0.94%，拟规定弯柄灵芝三萜及甾醇含量为：本品按干燥品计算，含三萜及甾醇以齐墩果酸（C30H48O3）计，不得少于0.90%。
4.3 本研究的局限性 由于弯柄灵芝为野生品种，资源较少，生长环境为五指山高山丛林，存在采样难度大的问题。本次采集的样品数量有限，未对其水分，灰分，酸不溶性灰分等做进一步考察，多糖和三萜及甾醇限度的最终确定还需更多样品测定数据积累确定。对于薄层色谱和含量测定，今后可考虑分离制备代表性成分灵芝酮A 和灵芝醇B后进一步完善其薄层色谱鉴别及高效液相色谱法测定主要三萜类成分含量。后续本课题组也将继续采集其他不同产地、不同年限的样品进行研究，以建立更加完善的药材质量标准。
5 结论
5.1 完善了弯柄灵芝的性状及显微鉴别特征 菌盖近圆形、半圆形或肾形，1.2～3.7cm×1.0～2.1 cm，厚0.2～1.1 cm；菌柄弯曲不规则，长7.5～20.9 cm，直径0.2～0.9 cm；有明显的类似灵芝样的木质清香味；显微鉴别观察到菌丝散在或粘结呈团状并可见少量孢子，呈椭圆形，分散不均，6.3～9.1 μm×6.3～8.1 μm。
5.2 建立了弯柄灵芝的专属性薄层色谱鉴别法 展开剂为石油醚-乙酸乙酯-甲酸（15∶[KG-*3/5]4∶[KG-*3/5]1，V/V/V）。
5.3 初步确定了弯柄灵芝多糖和三萜及甾醇限度 弯柄灵芝含多糖以无水葡萄糖（C6H12O6）计，不得少于0.80%；含三萜及甾醇以齐墩果酸（C30H48O3）计，不得少于0.90%。
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（收稿日期：2023-08-05 编辑：陶希睿）
基金项目：海南卫生健康职业学院校级基金［HWJ（XJJ）-20210104］。
作者简介：王升勇（1981—），男，黎族，本科，高级讲师， 研究方向为中药化学成分及显微鉴定。E-mail： 18667999@qq.com
作者简介：王勇（1982—），男，汉族，硕士，研究员，研究方向为菌物资源开发与利用。E-mail： wangyong 1982_2004@163.com
