印文静，颜海华，冯亚松，田 洁，王胜军 (.江苏省泰州市第四人民医院，江苏 泰州 5300;.江苏大学基础医学与医学技术学院，江苏 镇江 03)
细胞培养是现代生物医学的重要技术之一，在细胞生物学、生物化学、临床检验学等领域应用较为广泛，成为阐释生命现象、发病机理和筛选药物的重要手段，已成为医药生物技术产业的重要部分之一［1］。差速贴壁法由Kreider和Pleasure等较早报道［2］。该方法更加便于研究者简便探索细胞特别是胚胎干细胞诱导分化的机制，并有利于对结果进行精确、快速的检测。因此通过单层贴壁诱导途径进行细胞的培养、分化的研究报道越来越多［2］。本文对近年来采用差速贴壁法培养动物及人细胞的文献进行综述如下。
1 干细胞
胚胎干细胞是具有自我更新和多向分化能力的一类增殖旺盛的细胞，具有向机体各种组织细胞分化的潜能［3］。徐超等运用差速贴壁法分离鼠纤维母细胞(MEF)和小鼠胚胎干细胞(ES)［4］，实验不但找到了分离MEF和ES的最佳时间(约1.5 h)，而且结果还显示，差速贴壁后的GD3细胞仍然拥有保持其干细胞的全能性，其单克隆的形成率也和差速贴壁前的GD3细胞无显着差异，在很大程度上为差速贴壁法在干细胞分化中的应用提供了有力的实验证明。李甫强等运用差速贴壁法分离纯化绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠骨髓间充质干细胞［5］。实验结果显示，随着首次换液时间的延长，贴壁细胞密度增多，BMSCs的比例减少。首次换液时间在接种后2 h的细胞纯度高，但细胞密度低;24 h后的细胞密度高而纯度低;8 h后的细胞密度大具有较高的纯度，传代后的GFP转基因小鼠BMSCs能稳定表达GFP。傅淑平等采用差速贴壁法观察梓醇对SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖及骨向分化的影响［6］。结果表明，梓醇具有促BMSCs增殖及骨向分化的作用。而所采用的差速贴壁法为实验提供了较好的技术手段。刘虎仙等重复利用Ⅳ型胶原以差速贴壁法分选表皮干细胞［7］，研究表明，利用快速贴壁法可以得到较高纯度的表皮干细胞，合理回收利用Ⅳ型胶原以快速贴壁法分选表皮干细胞是一种实用而经济的方法。丁维进等运用改良的差速贴壁法分离肌源干细胞［8］，研究结果提示应用改良的差速贴壁法和有限稀释技术可以分离得到小鼠来源肌源干细胞及其克隆集落。
袁军等探讨差速贴壁法从早期人胚股骨分离、纯化骨髓间充质干细胞(BMSCs)的可行性，并观察培养细胞是否向神经元样细胞诱导分化［9］。研究结果表明，原代培养第3天可见塑料培养瓶内有长梭形细胞生长，至第10天前后形成集落样克隆，传至第4代后呈单层漩涡状排列的长梭形的成纤维样细胞，已无明显细胞克隆形成，经多次传代，细胞保持良好的增殖能力和稳定的性状;免疫细胞化学方法显示未诱导细胞神经元烯醇化酶、神经巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白阴性，诱导后细胞神经元烯醇化酶、神经巢蛋白呈阳性，胶质纤维酸性蛋白阴性，间接证实培养所得细胞是BMSCs。他们认为差速贴壁培养法从早期人胚股骨中分离纯化BMSCs，去除可能的成纤维细胞污染，是简便有效的，可供有关研究参考选择。
2 嗅黏膜嗅鞘细胞
田锋等采用经改良的取材和差速贴壁法培养纯化嗅SD大鼠黏膜嗅鞘细胞(OECs)［10］，以探求更加简单、高效的嗅黏膜OECs取材和培养纯化方法。实验结果表明，体外培养的嗅黏膜OECs形态主要有扁圆形或油煎蛋形、梭形或双极、多突起形，培养14 d嗅黏膜OECs纯度为85%，嗅黏膜OECs最长可以存活35 d。研究认为，采用改良的取材和差速贴壁法培养、纯化的嗅黏膜OECs，方法简单、高效，培养的嗅黏膜OECs的纯度可以达到细胞移植的要求。李玉安等探讨单次差速贴壁法纯化培养成年大鼠嗅球嗅鞘细胞的可行性，实验通过18 h单次差速贴壁法纯化培养的嗅鞘细胞经NGFRp75免疫荧光鉴定后，纯度可达70% ～80%，形态上以双极和三极细胞为主，伴有少许单极及多极细胞［11］。研究结果表明，应用18 h单次差速贴壁法纯化培养嗅鞘细胞是一种简便、稳定、经济、快捷的方法。
王斌等采用不同纯化方法原代培养人胚嗅球嗅鞘细胞(OECs)［12］，以差速贴壁法为基础结合阿糖胞苷法、无血清饥饿法和间断神经营养因子3(NT3)法纯化培养人胚嗅球OECs，观察不同纯化方法下OECs生长变化，采用免疫细胞化学染色进行纯度鉴定。实验结果表明，差速贴壁结合间断NT3法可获得高纯度状态良好的OECs，是一种简单实用的OECs纯化培养方法。
3 内皮祖细胞
李辰运等采用密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓血管内皮祖细胞［13］，于包被人纤连蛋白的25 ml培养瓶中贴壁培养，收集48 h后的未贴壁细胞培养至第7天，实验结果显示，差速贴壁法是获得稳定、高纯度的内皮祖细胞培养方法。
李建辉等利用免疫组化、免疫荧光及流式细胞术对培养的人脐血内皮祖细胞进行鉴定，建立一种内皮祖细胞的培养方法［14］，研究也同样表明，差速贴壁法培养内皮祖细胞的经济、可靠、稳定。
4 其他细胞
陈振兵等采用Ⅺ型胶原酶和胰蛋白酶消化法及差速贴壁法分离细胞获取小鼠肌源性干细胞，进行体外原代和传代培养［15］。实验结果显示，采用差速贴壁法可从失神经骨骼肌内分离出肌源性干细胞，体外培养的肌源性干细胞具有良好的增殖能力，适用于组织工程和基因治疗。孙浩林等采用胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶先后消化Wistar大鼠椎间盘髓核组织，差速贴壁法分离纯化大鼠腰椎间盘髓核细胞［16］。研究结果表明，原代培养、两次差速贴壁法分离纯化的大鼠髓核细胞代谢旺盛、表型一致。张群等将人毛囊外根鞘细胞(HHORSC)接种在Ⅸ型胶原涂被的培养皿上进行黏附分选，试验组细胞和对照组细胞分别进行K15、β1-整合素、外皮蛋白免疫荧光和流式细胞术检测细胞超微结构并测定克隆形成率［17］。研究结果表明试验组 K15和β1-整合素的表达分别为(70.1±6.7)% 和(82.4±9.3)%，对照组相应为(32.1±8.9)% 和(30.3±1.3)%，外皮蛋白两组间的表达为(26.7±8.6)%和(79.2±15.3)%，两组间差异有统计学意义(P＜0.05)。研究认为差速贴壁法可初步分选、纯化人毛囊干细胞。
采用差速贴壁法进行细胞培养具有经济、可靠、速度快、不用抗有丝分裂药物抗血清和补体等优点，在动物及人组织细胞的培养上具有广泛用途。但由于该方法本身的缺陷，成纤维细胞含量高于其他方法，在使用该方法培养细胞时需多加注意。但我们相信该方法将在以后的应用会越来越广泛。
［1］ 李 常，葛正行，李 波.大鼠气道成纤维细胞的分离、培养及鉴定［J］. 吉林医学，2012，33(19):4043.
［2］ Kreider B Q，Messing A，Doan H，et al.Enrichment of schwann cell cultures from neonatal rat sciatic nerve by differential adhesion［J］.Brain Res，1981，207(2):433.
［3］ 胡一新，黄 璟.小鼠胚胎干细胞饲养层的制备［J］.吉林医学，2009，30(9):778.
［4］ 徐 超，黄华荣，俞 宏，等.分离MEF和ES细胞的差速贴壁法研究［J］.分子细胞生物学报，2006，39(5):477.
［5］ 李甫强，周鸿鹰，羊惠君，等.差速贴壁法纯化分离GFP转基因小鼠骨髓间充质干细胞［J］.四川大学学报(医学版)，2006，37(2):301.
［6］ 傅淑平，张荣华.不同浓度梓醇对SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖及骨向分化的影响［J］.时珍国医国药，2012，23(10):2398.
［7］ 刘虎仙，贾赤宇，付小兵，等.重复利用IV型胶原以差速贴壁法分选表皮干细胞［J］.中国临床康复，2006，10(13):38.
［8］ 丁维进，唐 乙，宋艳玲，等.应用改良差速贴壁法和有限稀释技术分离培养小鼠来源肌源干细胞［J］.中国组织工程研究与临床康复，2011，15(36):6797.
［9］ 袁 军，单立冬，杨天明，等.差速贴壁法分离培养早期人胚骨髓间充质干细胞［J］.东南大学学报(医学版)，2005，24(4):218.
［10］ 田 锋，姜曙祥，贺西京，等.经改良的取材和差速贴壁法培养纯化嗅黏膜嗅鞘细胞［J］.细胞与分子免疫学杂志，2009，25(12):1189.
［11］ 李玉安，徐华梓，李万里.单次差速贴壁法纯化培养大鼠嗅神经鞘细胞的实验研究［J］.实用医学杂志，2009，25(10):1562.
［12］ 王 斌，贺西京，历 强，等.不同纯化方法体外培养人胚嗅球嗅鞘细胞［J］.四川大学学报(医学版)，2008，39(6):1023.
［13］ 李辰运，陈剑秋，孙晋津，等.差速贴壁法培养大鼠骨髓内皮祖细胞的实验研究［J］.天津医药，2011，39(4):353.
［14］ 李建辉，初少莉，姬开达，等.差速贴壁法体外培养人脐血内皮祖细胞的实验研究［J］.中华高血压杂志，2005，16(5):450.
［15］ 陈振兵，洪光祥，陈燕花，等.差速贴壁法体外培养失神经骨骼肌肌源性干细胞的生物学特性［J］.中国临床康复，2006，10(33):7.
［16］ 孙浩林，李淳德.原代培养差速贴壁法分离纯化大鼠腰椎间盘髓核细胞［J］.中国组织工程研究与临床康复，2011，15(46):8569.
［17］ 张 群，杨光辉，丛 笑，等.差速贴壁法分选人毛囊干细胞的研究［J］.中华实验外科学杂志，2006，23(6):755.
