沈福玉 施建生
摘要：目的 观察6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine， 6-OHDA）损伤早期帕金森病（Parkinson's disease， PD）大鼠行为学及黑质部位组织学的变化特点。方法 偏侧前脑内侧束注射6-OHDA，通过阿扑吗啡诱发旋转试验、跨步调节试验和姿势部对称试验评估注射后24 h、7 d及28 d大鼠行为学的变化；通过免疫组织化学染色观察黑质部位酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase， TH）阳性细胞计数的变化。结果 6-OHDA组大鼠跨步调节试验评分减少，姿势不对称试验评分增加，阿扑吗啡诱发大鼠向损伤对侧旋转，与对照组和假手术组比较统计学差异显着（P<0.05）；6-OHDA 7 d组、28 d组与24 h组比较，跨步调节试验评分进一步减少、姿势不对称试验评分进一步增加，阿扑吗啡诱发旋转次数增加，有统计学差异（P<0.05）；6-OHDA 24 h组黑质TH阳性细胞减少，与对照组和假手术组比较有统计学差异（P<0.05），7 d组及28 d组TH阳性细胞进一步减少，与24 h组比较统计学差异显着（P<0.05）。结论 通过阿扑吗啡诱发旋转结合非药物诱发试验进行行为学评估，可确定偏侧前脑内侧束注射6-OHDA损伤早期帕金森病动物模型。
关键词：帕金森病；大鼠；6-羟基多巴胺
帕金森病（PD）是常见的中老年人中枢神经系统退行性疾病，其病因及发病机制目前尚不清楚， 研究认为可能与遗传、环境因素、线粒体功能障碍、兴奋性氨基酸、氧化应激、过多的自由基形成及神经生长因子缺乏等有关，是多种机制协同作用的结果[1-2]。偏侧6-OHDA损毁模型是目前使用最多的PD动物模型之一，其在症状、病理、生化方面的表现与人类PD有不少相似之处，但该模型的损伤程度因6-OHDA的剂量、浓度、注射位点不同而存有争议，特别是对损伤早期大鼠行为学方面的观察比较缺乏。本实验通过观察6-OHDA损伤早期PD大鼠行为学及黑质部位组织学的变化特点，验证损伤早期PD大鼠模型的稳定性及可靠性。
1资料与方法
1.1一般资料 选用健康雄性SD大鼠40只， 体重 250～300 g，由南通大学实验动物中心提供。6-OHDA、抗坏血酸干粉剂、盐酸阿朴吗啡（apomorphine）、抗酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase， TH）抗体均购于Sigma公司。
1.2方法
1.2.1实验动物分组 40只SD大鼠随机分为三组：①空白对照组（n=8）；②6-OHDA模型组（n=24）：分为24 h组（n=8）、7 d组（n=8）和28 d组（n=8）3个亚组；③假手术组（n=8）。
1.2.2动物模型 模型组大鼠用复合麻醉剂（含戊巴比妥钠、丙二醇、硫酸镁等，0.25 mL/100 g体重）腹腔注射麻醉，待大鼠后肢回缩反射及角膜反射消失后，将其头部水平位固定在脑立体定位仪上，剪除颅顶鼠毛，碘酒、酒精消毒皮肤，沿中线切开一长约2cm切口，充分暴露前囟，参照Paxinos & Watson（1996）《大鼠脑立体定位图谱》确定左侧前脑内侧束（mfb）三维坐标位置，选取mfb区坐标：前囟后2.8 mm，中线左侧2.0 mm，硬膜下8.2 mm。根据注射位点确定钻颅部位，手术刀尖小心钻开一直径约2 mm颅骨孔，微量进样器缓慢进针至靶点，留针10 min，以9 ng/s的速度注入2 μg/μL 6-OHDA 4 μL（含0.02%抗坏血酸），注射完毕后留针5min，以1mm/min的速度退针。手术完毕，用明胶海绵堵塞颅骨孔，适量青霉素涂敷创口，消毒缝合皮肤，放回笼中饲养。并于24 h、7 d、28 d分别检测大鼠行为学和组织学的改变。假手术组同法予含0.02%抗坏血酸的生理盐水4 μL，空白对照组不作任何处理。
1.2.3行为学检测
1.2.3.1跨步调节试验[3] 将大鼠身体的后半部分拖起 ，并使大鼠身体重量仅由一侧前肢支撑 ，记录10s内大鼠这一前肢走步次数 ，然后同法检测另一前肢的情况，以损伤对侧前肢行走次数所占比例（损伤对侧前肢行走次数/（损伤对侧前肢行走次数+损伤侧前肢行走次数））为评价指标。
1.2.3.2姿势不对称性试验[4] 握住鼠尾的中后部将其提起，悬空于实验台上方约10 cm处，使大鼠头向下处于垂直状态， 以其偏离垂直轴不超过10°为垂直位（标准位），记录大鼠头或上身左右摆动的情况，以摆动偏离垂直位并再返回到垂直位记数为1次。观察45 s内大鼠头或身体转动的方向和次数，以向损伤对侧摆动的次数所占比例（损伤对侧摆动的次数/（损伤对侧摆动的次数+损伤侧摆动的次数））为评价指标。
1.2.3.3阿扑吗啡诱发旋转试验 模型组分别于术后24 h、7 d、28 d于动物腹腔内注射阿扑吗啡0.5 mg/Kg 诱发大鼠向右侧（健侧）旋转，于阿扑吗啡注射后5 min开始记录，持续记录30 min。以24 h诱发旋转次数<210次/30 min，并于7 d、28 d诱发旋转次数>210次/30 min为合格模型。
1.2.4组织学检测
1.2.4.1动物灌注、固定、取材、切片 各组大鼠在最后一次行为学检测后，用复合麻醉剂麻醉，剪开大鼠胸腔，经主动脉快速灌注生理盐水（37℃）150～200 mL冲洗，至大鼠肝脏发白，流出液基本无色为止。随即灌注4%甲醛（4℃）先快速灌注 200 mL，再缓慢灌注300 mL，至头与四肢均已发硬。断头取脑，置于4%甲醛，放4℃冰箱固定4 h，再依次置入20%及30%蔗糖磷酸盐缓冲液内，存4℃冰箱至脑块沉入瓶底。取中脑黑质组织块进行冠状连续冰冻切片，片厚20 μm。
1.2.4.2抗TH染色 作漂片SABC法染色，具体步骤依次为：冰冻切片用0.01 M（pH7.4）磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗3次，5 min/次。0.3% H2O2抑制内源性过氧化物酶活性， 0.02 mol/L EDTA（95℃）复性（2 min），非免疫的正常羊血清，室温下孵育30 min，抗TH抗体（1∶1000，抗体稀释液稀释），37℃孵育4 h， SABC试剂，室温下孵育1 h， DAB显色（阳性产物为棕黄色）。以上各步骤之间均以0.01M（PH7.4）PBS漂洗3次，5 min/次，正常羊血清与抗TH抗体孵育之间不漂洗。显色后贴片，自然风干，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
1.2.4.3 TH阳性神经元记数 各组大鼠取包含黑质致密部最明显的中脑切片，在×100倍显微镜下计数两侧黑质有完整细胞体的TH阳性细胞，计算左侧与右侧黑质TH阳性细胞数的百分比（左侧黑质TH阳性细胞数/右侧黑质TH阳性细胞数×100% ）。参照蔡文琴等[5]介绍的神经细胞计数方法进行细胞计数。
1.2.5统计学分析 数据结果均使用 SPSS13.0软件进行统计学分析。数据资料采用均数±标准差（x±s）表示。单因素方差分析进行差异性检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1行为学观察 对照组及假手术组大鼠经阿扑吗啡诱发后无旋转行为，也未出现非药物诱发的行为学改变。模型组大鼠在注射6-OHDA后数小时即出现损毁侧肢体动作减少，身体重心偏向损毁侧，并出现身体向损毁侧缓慢旋转，不能进行直线或随意爬行。
2.1.1跨步调节试验 对照组及假手术组大鼠两侧前肢10 s内跨步次数基本相同，模型组大鼠在左侧前脑内侧束注射6-OHDA后24 h跨步调节试验评分出现有意义减少，7 d及28 d评分进一步减少，见表1。
2.1.2姿势不对称试验 在左侧前脑内侧束注射6-OHDA后24 h，姿势不对称试验结果显示模型组大鼠头部和身体出现向右侧转动次数有意义增加，7 d及28 d姿势不对称试验评分进一步增加，对照组及假手术组大鼠头部和身体向两侧转动次数大致相同，见表2。
2.1.3阿扑吗啡诱发旋转试验 在注射6-OHDA后24 h，阿扑吗啡腹腔注射诱发大鼠以右侧后肢为支点，首尾相接向右侧旋转，30 min旋转次数<210次，7 d和28 d时大鼠阿扑吗啡诱发旋转次数>210次/30 min，对照组及假手术组大鼠未诱发出旋转行为，见表3。
2.2组织学检测 抗TH染色结果显示，在左侧前脑内侧束注射6-OHDA后24 h，大鼠左侧黑质TH阳性神经元数目出现有意义减少，高倍镜下见少部分神经元出现胞体肿胀、核膜界限消失等变性征象，部分神经轴突断裂、错乱；7 d和28 d时大鼠左侧黑质TH阳性神经元几乎消失，残留的TH神经元表现出染色质浓缩坏死现象，神经轴突散在稀疏；模型组大鼠右侧黑质TH阳性神经元数目同时也有部分减少；对照组及假手术组大鼠两侧黑质TH阳性神经元无明显改变，见表4，图1。
3讨论
研究PD需要建立稳定可靠的模型。6-OHDA是一种选择性中枢儿茶酚胺能神经元毒性物质，具有很强的呼吸链抑制作用，偏侧6-OHDA损毁模型是目前使用最多的PD模型之一。1970年Ungerstedl[6]首先报道了应用6-OHDA成功制备大鼠偏侧PD模型，这种模型能够在多巴胺能药物的诱发下产生旋转行为，以便于判断模型成功与否。阿扑吗啡是多巴胺（dopamine，DA）受体激动剂，能够引起该模型向健侧旋转，这是由于损伤侧纹状体多巴胺含量下降，多巴胺D2受体代偿性大量增加，且敏感性增高，出现超敏现象[7]，此时应用DA受体激动剂使损伤侧兴奋作用占优势而产生向健侧旋转。
PD的神经保护治疗需要早期进行，评估6-OHDA损伤早期大鼠行为学变化，可进一步明确模型是否成功及神经保护性治疗是否有效。阿扑吗啡诱发旋转试验结合非药物诱发的行为学试验，其评估结果更加有效、可靠[8]。在偏侧前脑内侧束注射6-OHDA后数小时，大鼠出现肢体动作减少，身体重心偏向损毁侧，并出现身体向损毁侧不自主旋转，不能进行直线或随意爬行，6-OHDA注射后24 h大鼠跨步调节试验和姿势不对称试验出现有意义改变，腹腔注射阿扑吗啡后可诱导大鼠在原地向健侧旋转，以健侧后肢为支点，首尾相接，形成环状，但旋转次数<210次/30 min，提示此时大鼠黑质DA神经元已经受到破坏。免疫组化染色结果也表明偏侧前脑内侧束注射6-OHDA后24 h，大鼠左侧黑质TH阳性神经元减少约30%，部分神经元出现胞体肿胀、核膜界限消失等早期变性征象，部分神经轴突断裂、错乱。
偏侧前脑内侧束注射6-OHDA后24 h大鼠出现行为学和组织学方面的变化，为检测模型的稳定性和可靠性，实验设立6-OHDA损伤后7d和28d组。结果显示：大鼠行为学改变较24 h组更加显着，阿扑吗啡诱发旋转次数>210次/30 min，符合成功PD模型标准；7 d和28 d时大鼠左侧黑质TH阳性神经元减少90%。偏侧前脑内侧束注射6-OHDA后，损伤对侧有部分DA能神经元丢失，可能与药物的渗透作用或经血液循环等有关。
综上所述，通过早期行为学检测，可为神经保护性研究确立合格的PD模型，避免了药物提前干预存在的药物显效与模型失败之间的争议。
参考文献：
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[4]Roghani M， Behzadi G， Baluchnejadmojarad T. Efficacy of elevated body swing testing the early model of Parkinson disease in rat [J]. Physiology & Behavior， 2002， 76（4-5）： 507-510.
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[6]Ugerstedl U， Arbuthnott G. Quantitative reording of rotational behavior in rats after 6-hydroxydopamine lesions of the nigrostriatal dopamine system [J]. Brain Res， 1970， 24： 485.
[7]何建成， 袁灿兴， 卫洪昌.6-羟基多巴胺制备帕金森病大鼠模型的神经行为学特点[J].中国临床康复，2005，9（29）：68-69.
[8]张耀芬，段德义，徐群渊.6-羟基多巴胺帕金森病大鼠模型的制作和行为学评价[J].解剖科学进展，2005，11（1）：49-50.
编辑/张燕
