何双
摘要：目的 观察胚胎停育妇女绒毛织组中caspase-3和survivin的表达，探讨过度凋亡与胚胎停育的关系。方法 选取2018年5月1日～12月31日在天津市第一中心医院妇科计划生育门诊确诊胚胎停育患者30例作为观察组，另选取同期在我院计划生育门诊正常妊娠要求人工流产的患者30例作为对照组，采用SP法检测两组患者绒毛组织中caspase-3和survivin的表达。结果 对照组光镜下见绒毛组织大小一致，绒毛间可见正常结构的间充质细胞。观察组光镜下见绒毛组织发生不同程度的退行性改变，间充质变性，结构模糊，同时伴炎性反应;观察组绒毛组织细胞及对照组绒毛组织细胞皆有caspase-3蛋白的表达，观察组绒毛组织caspase-3表达量高于对照组，观察组阳性率为96.66%，高于对照组的86.66%，差异有统计学意义（P<0.05）;观察组绒毛组织细胞及对照组绒毛组织细胞皆有survivin蛋白的表达，观察组绒毛组织survivin表达量低于对照组，观察组阳性率为73.33%，低于对照组的96.66%，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 胚胎停育可能与绒毛组织中caspase-3高表达、survivin低表达导致的细胞凋亡过度有关。
关键词：胚胎停育;caspase-3;survivin;凋亡
中图分类号：R714.2 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.19.023
文章编号：1006-1959（2019）19-0080-03
Study on the Relationship Between Caspase-3，Survivin and Embryonic Stop
HE Shuang
（Department of Obstetrics and Gynecology，Tianjin First Central Hospital，Tianjin 300192，China）
Abstract：Objective To observe the expression of caspase-3 and survivin in embryos and women's chorionic villi， and to explore the relationship between excessive apoptosis and embryonic cessation.Methods From May 1st to December 31st， 2018， 30 cases of embryos were diagnosed in the gynecological family planning clinic of the First Central Hospital of Tianjin as the observation group， and the abortion was performed in the normal pregnancy of the family planning clinic in our hospital.30 patients were used as the control group. The expression of caspase-3 and survivin in the villus tissues of the two groups was detected by SP method.Results In the control group， the size of the villus was consistent under the light microscope， and the mesenchymal cells with normal structure were observed between the villi. Under the light microscope， the villus tissue showed different degree of degenerative changes， mesenchymal degeneration， structural ambiguity， and inflammatory reaction. The expression of caspase-3 protein was observed in the villous tissue cells of the observation group and the villus tissue cells of the control group. The expression of caspase-3 in the villus tissue of the observation group was higher than that of the control group. The positive rate of the observation group was 96.66%，the difference of 86.66% in the control group was statistically significant （P<0.05）. The expression of survivin protein was observed in the villous tissue cells of the observation group and the villous tissue cells of the control group. The expression of survivin in the villus tissue of the observation group was lower than that of the control group. The positive rate was 73.33%， which was lower than that of the control group 96.66%，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion Embryo arrest may be associated with excessive expression of caspase-3 in villus tissues and excessive apoptosis induced by low expression of survivin.
Key words：Embryonic stop;Caspase-3;Survivin;Apoptosis
随着国家二胎政策的开放，妊娠妇女人数增多，胚胎停育的发病率也逐步升高，调查显示胚胎停育的患者高达13.4%[1]。胚胎停育，又称稽留流产，是指胚胎或胎儿已死亡滞留宫腔内未能及时自然排出[2]。有研究显示细胞过度凋亡参与了胚胎停育的发生[3]。Caspase-3是在胎盘绒毛组织表达的一种促凋亡蛋白，survivin是在胎盘绒毛组织表达的一种细胞凋亡抑制蛋白，本研究通过检测胚胎停育患者绒毛组织中caspase-3、survivin的表达，分析细胞过度凋亡与稽留流产的关系，进而指导临床采取有效的预防措施，以期为优生优育指导提供理论依据。
1资料与方法
1.1一般资料 选取2018年5月1日～12月31日在天津市第一中心医院计划生育门诊确诊胚胎停育需行清宫术的患者30例作为观察组，另随机选取同期在我院计划生育门诊正常妊娠要求人工流产的患者30例作为对照组。本研究已通过医院伦理委员会审批，患者及家属知情同意并签署知情同意书。纳入标准：①月经周期规律;②血HCG阳性，经我院B超确诊宫内孕，对照组患者B超显示有胎心搏动，观察组患者B超显示可见胎囊无胎心搏动。排除标准：①近半年内曾服用激素类药物;②曾放置宫内节育器;③有药物过敏史;④有生殖系统急性炎症及肿瘤;⑤合并内外科相关疾病。观察组年龄20～40岁，平均年龄（26.83±5.52）岁;停经40～63 d，平均停经（44.00±3.20）d;胎囊最大径线1.5～2.0 cm，平均径线（1.90±0.45）cm。对照组年龄20～40岁，平均年龄（27.33±5.46）岁;停经40～63 d，平均停经（45.00±2.23）d，胎囊最大径线1.4～2.0 cm，平均径线（1.82±0.35）cm。两组年龄、停经时间及胎囊径线比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2方法 负压吸宫术后取绒毛组织置于生理盐水中冲洗2次，取小于0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm组织块，置于4%多聚甲醛固定，取材，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后石蜡包埋，连续切片厚度为5 μm;将切片置于二甲苯及梯度乙醇中脱蜡，自来水及PBS冲洗后依次入甲醇双氧水、蒸馏水及MPBS冲洗;将切片放入抗原修复液中经加热、冷却及PBS冲洗进行修复，切片上滴加正常山羊血清封闭液室温20 min后滴加第一抗体（caspase-3及survivin抗体），4℃过夜，MBPS冲洗5 min×3次;滴加生物素化第二抗体（IgG），37℃，20 min，MBPS冲洗5 min×3次;切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃，20 min，MBPS冲洗，5 min×3次;使用混匀DAB显色试剂加至切片上显色6 min，充分水洗;经过苏木素复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明后中性树脂封片，在光镜下观察。
1.3判定标准 光镜下观察细胞内出现浅棕黄色、棕黄色 、棕褐色颗粒为survivin、caspase-3阳性细胞。阳性着色细胞分级：（A）判断标准：<25%记0分，25%～50%记1分，50%～75%记2分，>75%记3分。阳性细胞着色强度（B）判断标准：无着色或背景均匀一致，淡黄色记0分;浅棕黄色记1分;棕黄色记2分;棕褐色记3分。随机选取5个不重叠的高倍视野（×400倍），根据两项指标的积分数（积分=A×B）积分。积分0分：（-），1～3分：（+），4～6分：（++），7～9分：（+++）。
1.4统计学方法 所有数据用SPSS 18.0统计软件处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验。计数资料用（n，%）表示，比较采用？字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1两组病理形态比较 对照组患者光镜下见绒毛组织大小一致，内层细胞滋养细胞边界清晰，外形为卵圆形或立方形，细胞浆透明，外层合体滋养细胞，细胞核深染且有多个。绒毛间可见正常结构的间充质细胞，见图1。观察组患者光镜下见绒毛组织发生不同程度的退行性改变，滋养层细胞数量明显减少并发生萎缩，间充质变性，结构模糊，同时伴炎性反应，见图2。
2.2两组绒毛组织中caspase-3表达比较 观察组绒毛组织细胞及对照组绒毛组织细胞皆有caspase-3蛋白的表达，观察组绒毛组织caspase-3表达量高于对照组，观察组阳性率高于对照组，差异有统计学意义（？字2=16.364，P=0.001），见表1。
2.3两组绒毛组织中survivin表达比较 观察组绒毛组织细胞及对照组绒毛组织细胞皆有survivin蛋白的表达，观察组绒毛组织survivin表达量低于对照组，观察组阳性率低于对照组，差异有统计学意义（？字2=8.419，P=0.038），见表2。
3讨论
胚胎停育近年来一直是妇产科优生与遗传领域的研究热点，其发病原因错综复杂，具体发病机制尚未明确[4]。目前认为与染色体异常、内分泌异常、感染、抗生殖免疫抗体、年龄、环境等因素相关。随着分子生物学技术的发展，越来越多的研究证实胚胎停育促凋亡基因及抑制凋亡基因表达异常相关[5，6]。受精卵着床后，经过定位、黏附和侵入三个过程，滋养细胞穿透侵入子宫内膜，辅助胚胎着床。正常情况下，滋养细胞通过细胞抗凋亡与细胞凋亡之间的平衡实现细胞增殖，在妊娠早期，应以绒毛和蜕膜组织细胞增殖为主[7]，妊娠晚期应以细胞凋亡为主，绒毛组织细胞增殖/凋亡的平衡状态有利于绒毛内血管及分支形成和相关的侵袭能力的保持[8]。细胞凋亡是主动、有序由基因调控的自我凋亡过程，通过清除坏死细胞，分解ATP，进入能量循环[9]。本研究从促凋亡因子caspase-3与抑制凋亡因子survivin入手，证实二者介导的细胞凋亡过度参与了胚胎停育的发生。
促凋亡蛋白caspase-3是caspase家族中的一员，caspase家族是一组在细胞凋亡机制中占据重要地位的蛋白酶，又称“天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶”，特异性作用于底物的天冬氨酸残基，caspase-3及其前体pro-caspase-3是目前发现的在胚胎胎盘组织中唯一表达的caspase成员，与CED-3同源性最高，处于caspase家族介导的细胞凋亡传导通路的下游，其表达增高会启动线粒体/细胞色素C及Fas介导的细胞凋亡通路。Caspase-3一旦被激活，凋亡将不可逆转，凋亡通路一旦活化将促使胚胎绒毛细胞大量凋亡[10]，绒毛细胞过度凋亡势必阻碍绒毛组织生长，导致胚胎停止发育。可以认为绒毛组织中caspase-3表达增加，提示绒毛组织中存在细胞过度凋亡。本研究中，观察组绒毛组织及对照组正常早孕绒毛组织中皆有caspase-3的表达，表明促凋亡蛋白caspase-3参与了正常生理状态下绒毛滋养细胞增殖/凋亡的平衡，而观察组绒毛组织中caspase-3的表达量高于对照组（P<0.05），证明胚胎停育患者绒毛组织中caspase-3基因高表达，细胞凋亡信号过强， caspase-3蛋白产生过量，细胞凋亡过度，打破了绒毛滋养细胞增殖/凋亡的平衡，导致胚胎停止发育。
抑制凋亡因子survivin是细胞凋亡抑制蛋白（inhibiting apoptosis protein，IAP）中最小的成员，是迄今为止发现作用最强的凋亡抑制因子，是由Ambrosini等应用效应细胞蛋白酶受体-1的cDNA通过杂交的方法在人类基因组文库中筛选出来。Survivin主要在胚胎组织及肿瘤组织中表达，在分化成熟的正常组织中表达水平较低[11]。Survivin在调控细胞周期、抑制细胞凋亡的过程中发挥重要作用，其通过抑制线粒体/细胞色素C介导的细胞凋亡通路，阻断下游的caspase活化以及抑制p53的功能等多种途径发挥抗凋亡作用[12]。此外，survivin还可以上调同家族其它成员的作用，进而调节细胞周期调节因子，间接调控妊娠早期高度增生的细胞滋养细胞凋亡。有研究显示[13]，米非司酮可以下调survivin蛋白的表达，以诱导早孕绒毛、蜕膜组织细胞凋亡，达到抗早孕的目的。王莉等[14]研究显示，早产胎盘组织中survivin的表达明显低于足月分娩组，证实survivin低表达引起的细胞过度凋亡导致了不良妊娠结局。本研究应用免疫组化法，检测到观察组绒毛及对照组绒毛组织中皆有survivin蛋白的表达，而观察组绒毛组织中survivin蛋白表达量低于对照组（P<0.05），证明survivin的低表达使抗凋亡作用减弱，caspase-3过量表达间接诱发细胞过度凋亡，阻碍绒毛增殖，胚胎停止发育。
综上所述，绒毛组织中caspase-3、survivin蛋白的异常表达与胚胎停育发生密切相关。本研究目前仅从组织学方面研究caspase-3、survivin与胚胎停育发生的关系，尚未在临床诊治中进行探讨，因样本数量有限，且引起胚胎停育的原因众多，caspase-3、survivin引起细胞凋亡的分子生物学机制需要更多的细胞凋亡的基础性研究支持，从而指导临床诊治及预防胚胎停育。
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