徐艳琼，唐 铭，杨承纲

（1.昆明医科大学第三附属医院病理科，云南 昆明 650100；2.云南省第一人民医院，云南 昆明 650034）

甲状腺癌（thyroid cancer）是一种增殖率最高的内分泌系统肿瘤，近年来发病率不断升高[1，2]。由滤泡细胞产生的分化型甲状腺癌（DTC）进一步细分为乳头状甲状腺癌（PTC）、滤泡性甲状腺癌（FTC）和许特尔细胞癌（HTC），其中PTC 是最常见的组织学类型[3]。DNA 甲基化是恶性肿瘤常见的表观遗传修饰，抑癌基因的甲基化可以影响基因的表达水平，从而有利于肿瘤的发生发展。对肿瘤甲基化的检测，有助于制定肿瘤的治疗方案以及预后评估[4]。近年来研究显示，多个基因与甲状腺肿瘤的发生发展相关。Khatami F 等[5]报道CDH1 和SCL5A8 基因与甲状腺癌的发生风险相关；谢小红等[6]发现PCDH8 基因甲基化与乳头状甲状腺的发生发展相关。乙酰辅酶A羧化酶β（ACACB）是乙酰辅酶A 的一种亚型蛋白，能阻碍脂肪酸的β 氧化过程，在脂质代谢中起重要作用的基因[7]。在肿瘤细胞中，95%的脂肪酸是从头合成的，会有脂肪酸的积累，积累到一定程度时会形成乳腺肿瘤组织的膜脂质，影响细胞的信号传导，进而影响机体的生命活动[8]。对ACACB 进行生物信息学分析发现，其在喉部鳞状细胞癌、三阴性乳腺癌、视网膜母细胞瘤、黑色素瘤中低表达。有研究报道对调控PTC 进程的基因进行生物信息学分析，发现与脂肪代谢密切相关的ACACB 表达量显着下调，并被预测为是与PTC 患者预后相关的基因[9]。ACACB 在甲状腺乳头状癌中表达水平降低可能与其甲基化有关[10]。本研究通过对甲状腺乳头状癌患者进行研究，旨在检测ACACB 在甲状腺乳头状癌患者中的甲基化和蛋白表达水平，探讨其作为预后和生存指标的可能性，为临床精准治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料来源 于2020 年11 月-2021 年3 月在云南省第一人民医院采集10 例乳头状甲状腺癌患者的肿瘤组织和癌旁正常组织样本，所有组织采集后保存在-80 ℃冰箱，以备后续实验使用。

1.2 主要试剂 ACACB 多克隆抗体（货号：PA5-52309；品牌：Thermo Fisher）和TaqManTM 逆转录试剂（货号：N8 080234；品牌：Thermo Fisher）购买自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒（货号：DP304-02；品牌：TIANGEN）购买自云南表达科技有限公司；蛋白提取试剂盒（货号：ab 270054；品牌：abcam）购买自昆明贝尔吉科技有限公司；引物合成自昆明擎科生物科技有限公司。

1.3 ACACB 基因启动子甲基化检测 按照DNA 提取试剂盒说明书提取癌和癌旁组织基因组总DNA，甲基化特异性PCR（MSP）上游引物MF1：AATTTTGAAGAGAATGTGGTAAT 和下游引物：MR1：TTTAAAAAACAAACCCCCATTAAA；甲基化非特异性 PCR（USP）上游引物：UF1：TGGGTTGGGTATTGTGTAGGTA 和下游引物UR1：AACCCTCAAATCACACCAC。甲基化检测PCR 扩增条件为：95 ℃预变性3 min，后续30 个循环扩增（95 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s），循环结束，72 ℃延伸2 min，最后4 ℃保持。

1.4 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）提取乳头状患者癌细胞中的RNA，使用TaqManTM 逆转录试剂逆转录成CDNA 后，使用上游引物ACACB F1：AAAGAAACACGGGCTTGAGTTGG 和下游引物 ACACBR1：TGATCTTTAGGCACCTGTGTGCT 进 行q RT-PCR。β-actin 最为内参，其上游引物序列：5'-ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3'，下游引物序列：5'-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3'。PCR 程序ACACB：95 ℃预变性3 min，30 个循环（94 ℃变性30 s、60 ℃退火25 s、72 ℃延伸30 s）72 ℃延伸5 min。β-actin：95 ℃预变性3 min，28 个扩增循环（94 ℃变性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸5 min，随后4 ℃保持。

1.5 蛋白质免疫印迹分析（WB）提取乳头状甲状腺癌和癌旁组织总蛋白质，定量变性后，进行SDSPAGE 电泳，转膜后进行脱脂牛奶孵育2 h，孵育结束后PBST 洗膜3 次，每次5 min，按照1∶1000 稀释ACACB 抗体，过夜孵育后进行显影检测，每组进行3 次重复实验。

1.6 数据分析 使用软件Image J 计算WB 图片每个条带的灰度值，随后将各组灰度值输入软件Graph－Pad Prism 8 进行柱状图绘制。

2 结果

2.1 ACACB 基因mRNA 表达量分析 与癌旁正常组织相比，乳头状甲状腺癌组织中ACACB 基因mRNA 水平均下调，且不同乳头状甲状腺癌样本中ACACB 水平下调水平差异较大，2、5、31 和28 号样本中乳头状甲状腺癌组织和癌旁正常组织的ACACB基因mRNA 表达水平差异最大；25、26 和27 号样本中乳头状甲状腺癌组织和癌旁正常组织的ACACB基因mRNA 表达水平差异最小，见图1。

图1 乳头状甲状腺癌组织和癌旁正常组织中ACACB 基因mRNA 表达量比较

2.2 ACACB 蛋白在乳头状甲状腺癌组织中的表达WB 检测显示，8 例患者的ACACB 基因蛋白水平低于癌旁正常组织，仅2 例患者（2 号和3 号样本）ACACB 基因的蛋白表达水平高于癌旁正常组织，ACACB 的表达量与乳头状甲状腺癌的发生密切相关，见图2。

图2 ACACB 蛋白在乳头状甲状腺癌组织中的表达

2.3 ACACB 基因启动子甲基化水平 甲基化特异性PCR 检测显示，在乳头状甲状腺癌组中ACACB 基因发生启动子甲基化的比率为60.00%（6/10），正常样本中ACACB 基因发生启动子甲基化的比率为30.00%（3/10）；另外有20.00%（2/10）的甲状腺癌组织和癌旁正常组织同时发生甲基化，见图3。

图3 ACACB 基因启动子甲基化水平

3 讨论

多个报道显示，在乳头状甲状腺癌中，癌组织中ACACB 基因mRNA 表达水平低于对应癌旁正常组织[11，12]，但其对于乳头状甲状腺癌的调控机制以及ACACB 基于表达异常的机制尚不清楚。本研究显示，不同来源样本的乳头状甲状腺组织中，癌组织和癌旁正常组织中ACACB 基因的mRNA 表达水平存在不同程度的差异。但WB 结果显示，8 例乳头状甲状腺癌组织的ACACB 基因蛋白水平低于对应癌旁组织，仅2 例乳头状甲状腺癌组织中ACACB 基因蛋白存在高表达；与此同时，60.00%的乳头状甲状腺癌组织存在启动子甲基化。因此，在乳头状甲状腺癌中ACACB 基因启动子甲基化会降低ACACB基因转录。

Li X 等[10]研究认为，乳头状甲状腺癌中ACACB基因mRNA 水平下降可能与其甲基化水平相关。本研究中，存在ACACB 基因启动子甲基化的癌组织中ACACB 基因的mRNA 水平均降低，25、26 和27号样本癌组织存在较低甲基化水平，同时其癌组织中ACACB 基因mRNA 水平与癌旁组织相差最小。

本研究不足之处：本次通过对乳头状甲状腺癌组织中ACACB 基因的表达水平及甲基化水平的研究，发现ACACB 基因表达异常与其甲基化水平相关，但ACACB 基因表达异常与甲状腺癌发生发展的关系仍不明确。与此同时，在少数样本中ACACB基因蛋白水平有一定程度上升，其原因尚不清楚，后续仍需在细胞层面对其调控机制进行探究。

综上所述，乳头状甲状腺癌中存在较高比例的ACACB 基因启动子甲基化，启动子甲基化的发生影响了基因的转录活性，同时其蛋白水平相应下降，但具体机制尚不清楚。