白冰，郭亚春，石凯行

（1.承德医学院基础医学院，河北 承德 067000；2.承德医学院附属医院皮肤科，河北 承德 067000）

肝脏是人体内物质代谢和起生物转化作用的重要器官，急性肝损伤（acute hepatic injury，AHI）是指由于酒精、病毒、化学药物等一种或多种因素导致的短时间内肝功能急剧损伤，损伤严重还可能导致肝功能衰竭伴有很多并发症，具有很高的致死率[1]。对于治疗肝损伤，目前国内外并没有合适的药物，因此寻找在临床上能够有效治疗肝损伤的药物成为研究热点。中药黄芩性苦寒，具有清热泻火、燥湿解毒之效，可以治疗黄疸[2]。黄芩主要成分为黄芩苷，具有抗炎、抗氧化等药理作用。据文献报道，黄芩苷对非酒精性脂肪性肝炎具有一定的治疗作用[3]，还对对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤小鼠具有保护作用[4]。由于水溶性差的特点，致使黄芩苷临床应用受到限制，而水溶性及稳定性极好的黄芩苷镁解决了这一问题[5]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）联合D-氨基半乳糖（D-Galactosamine，D-GalN）制备急性肝损伤模型是国内外公认的经典方法[6]，其诱导的急性肝损伤病理变化与临床乙肝病理变化类似[7]，主要是由炎症介导的免疫性肝损伤。当中毒、感染等内外因素刺激下，免疫调节作用失控，二者比例失衡，活化的免疫细胞分泌大量炎症因子，就可能会引起免疫功能紊乱，进而造成肝细胞损伤[8]。有报道D-GalN 致急性肝衰竭大鼠模型中存在Th 细胞分泌的炎症因子失衡[9]，在肝损伤的过程中IL-6、IFN-γ、TNF-α 等Th1 类细胞因子发挥主要作用[8]。因此，本研究拟通过检测炎症因子水平来探究黄芩苷镁尾静脉给药对LPS/D-GalN 诱导急性肝损伤大鼠的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 54 只SPF 级雄性SD 大鼠购于维通利华，许可证号SCXK（京）2016-0006，5 周龄，重（170±10）g，本研究已通过我校伦理委员会审批，批准文号：CDMULAC-20181219-006。大鼠饲养于SPF级环境。试剂及仪器：LPS、D-GalN（Sigma-Aldrich），异甘草酸镁（正大天晴药业），黄芩苷镁（纯度为85%，由承德医学院刘翠哲教授课题组提供），红帽负压液体采集管（不抗凝）国产（Bebolabs），大鼠IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α 试剂盒（联科生物），SIM-F124 制冰机（日本SANYO 公司），PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time）（TaKaRa），DEPC处理水（DNase、RNase free）（Beyotime），普通RIPA（组织/细胞）裂解液（附PMSF 1.5 ml）（Solarbio），引物（TaKaRa），PCR 仪（BIO-RAD）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理 大鼠适应性饲养1 周，按照随机数字表法分为模型组、正常组、黄芩苷镁（BAMg）高、中、低剂量组（100、50、25 mg/kg），异甘草酸镁组（MgIG）（18 mg/kg），每组9 只。给药组尾静脉注射相应浓度的药物连续7 d，1 次/d，模型及正常组以相同方法给予等量生理盐水。根据前期实验结果，确定造模条件为20 μg/kg LPS 联合400 mg/kg D-GalN，于12 h 后取材[8]。

1.2.2 ELISA 法检测血清炎症因子 取材，大鼠血液离心后得到血清置于冰上备用；在标准品孔中，分别加入呈比例稀释的标准品100 μl 作为标准曲线，加100 μl 标准品稀释液于空白孔内作为空白对照，在样本孔中，加入样本溶液20 μl、1×检测缓冲液80 μl；然后所有孔加入稀释好的检测抗体溶液50 μl；37 ℃孵育1.5 h；冲洗6 次；加辣根酶标记的链霉亲和素100 μl/孔；37 ℃孵育30 min；冲洗6 次；避光加入显色底物100 μl/孔，避光室温孵育30 min；加终止液100 μl/孔；30 min 内，上机检测450 nm 条件下的OD 值；处理数据，检测血清样本中IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 含量。

1.3 统计学方法 应用SPSS 24.0 统计软件分析数据，计量资料采用（±s）表示，使用单因素方差分析LSD 或Games-Howell 进行检验；计数资料采用[n（%）]表示，行χ2检验；设置检验水准α=0.05，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

模型组血清IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 水平高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）；黄芩苷镁高、中剂量组、异甘草酸镁组血清IL-6、IL-1β、IFN-γ水平低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；黄芩苷镁低剂量组血清IFN-γ 水平低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；黄芩苷镁低剂量组血清IL-6、IL-1β、TNF-α 水平与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；黄芩苷镁中、低剂量组血清IL-6、IL-1β、IFN-γ 水平高于异甘草酸镁组，差异有统计学意义（P＜0.05）；黄芩苷镁高剂量组血清IL-6、IL-1β、IFN-γ 水平与异甘草酸镁组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；黄芩苷镁高、中、低剂量组血清TNF-α水平与异甘草酸镁组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 各组血清IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 水平比较（±s，pg/ml）

表1 各组血清IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 水平比较（±s，pg/ml）

注：与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与异甘草酸镁组比较，cP＜0.05

3 讨论

黄芩苷镁是黄芩苷与镁离子耦合形成的水溶性化合物，它是黄芩苷在植物中的主要存在形式[10]。有文献报告黄芩苷在肾损伤、心肌损伤、脊髓损伤、肺损伤等方面均有一定的治疗作用[11-14]。课题组前期研究发现BA-Mg 可改善CCl4诱发的大鼠急性肝损伤[15]，其可能通过Nrf2/ARE 信号通路抑制氧化应激反应发挥保护作用[16]。有研究报道了黄芩苷镁对急性肺损伤小鼠就有一定保护作用[17]。因此本研究通过BA-Mg 预处理大鼠1 周后，进行LPS/D-GalN 诱导急性肝损伤[7]，研究BA-Mg 对LPS/D-GalN 诱导急性肝损伤是否有保护作用。

免疫应答是机体免疫系统识别并清除“非己”物质的整个过程，需要T、B 细胞及多种固有免疫细胞相互协调、共同作用完成[18]。T 细胞来源于骨髓造血干细胞，在胸腺发育成熟后定居在外周淋巴器官中的胸腺依赖区，当受到某些特定的抗原刺激后就会被激活、增殖，并分化为发挥效应的T 细胞和具有记忆作用的T 细胞，通过淋巴细胞再循环周游全身发挥免疫调节和细胞免疫功能[19]。依据T 细胞在免疫应答中的功能，将其分为辅助性T 细胞（Th 细胞）、细胞毒性T 细胞（Tc 细胞）和调节性T 细胞（Treg 细胞）。Th 细胞主要分为Th1、Th2 细胞，其中Th1 细胞活化分泌IL-1、IL-2、IFN-γ、TNF-α 等因子，Th2 细胞活化分泌IL-4、IL-6、IL-10 等因子。正常生理状态下，Th1/Th2 细胞处于动态平衡，调节机体正常免疫应答，在肝损伤状态下导致二者比例失衡，促炎因子大量分泌，进而可能会引起免疫功能紊乱[8]。由此，实验研究检测了大鼠血清中促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 含量。

本研究发现，AHI 大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 水平高于正常组（P＜0.05），与文献报道相一致[20,21]，提示LPS/D-GalN 诱导的AHI 过程中，可能使Th1 细胞过度活化，大量分泌IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 等因子，进而导致炎症反应。黄芩苷镁高、中、低剂量组可以降低LPS 联合D-GalN 致急性肝损伤大鼠血清中IL-6、IL-1β、IFN-γ的水平，其中以黄芩苷镁高、中剂量组较为突出（P＜0.05）。黄芩苷镁高、中、低剂量组血清中TNF-α 水平有下降的趋势，与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示TNF-α 可能并不是BA-Mg 影响的主要因子。因此，BA-Mg 可能通过抑制Th1 细胞的过度活化，进而抑制分泌促炎因子，发挥抗炎作用。黄芩苷镁高剂量组血清炎症因子IL-6、IL-1β、IFN-γ 水平与异甘草酸镁组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），黄芩苷镁中、低剂量组血清炎症因子IL-6、IL-1β、IFN-γ水平较异甘草酸镁组高（P＜0.05），提示高浓度BA-Mg 可能与MgIG的抗炎效果一致。

综上所述，LPS 联合D-氨基半乳糖可造成急性肝损伤，释放大量炎症因子。基于前期AHI 模型建立的条件，黄芩苷镁可以通过抑制炎症因子产生来发挥保肝作用，但黄芩苷镁是否通过影响Th1、Th2细胞增殖来抑制炎症因子产生，有待进一步研究。