运用网络药理学和分子对接技术探究瘀血痹胶囊抗神经病理性疼痛的活性成分与作用机制

杨志城 孙彩虹 房庆伟 吴若铭 李坤 叶冠

（上海医药集团股份有限公司中央研究院 上海 201203）

神经病理性疼痛（neuropathic pain, NP）是指由机体感觉神经系统的损伤或疾病引起的疼痛[1]，其全球人口患病率约为3.3% ～ 8.2%[2]，欧洲人群的患病率可能高达8%[3]，推测我国约有9 000万NP患者，占慢性疼痛患者总数的20% ～ 25%[4]。对于NP，目前临床上缺乏根治方法和特效药物。因此，积极探寻疗效确切且不良反应小的NP治疗药物具有重要的现实意义。

瘀血痹胶囊由当归、丹参、炙乳香等11味中药组成，有活血化瘀、通络定痛之功效，现临床上主要用于缓解某些患者的关节疼痛症状。目前，关于瘀血痹胶囊的镇痛作用虽已见动物模型[5]、临床药效学[6]和基于单味药的镇痛机制[7-9]研究报告，但缺乏整体性研究。本研究运用网络药理学和分子对接技术探究瘀血痹胶囊可能具有的抗NP活性成分及其作用机制，为拓展瘀血痹胶囊治疗NP新用途提供理论依据。

1 工具与方法

1.1 数据库和软件

数据库：TCMSP数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）；Genecards数 据 库（http://www.genecards.org）；UniProt数据库（https://www.uniprot.org）；STRING数据库（https://string-db.org）；DAVID数 据 库（https://david.ncifcrf.gov/）。

软件：R3.6.3；Cytoscape 3.7.2；Discovery Studio 2019。

1.2 化学成分的收集和筛选

在TCMSP数据库中，以瘀血痹胶囊所含单味药的中文名进行检索，收集整理后取口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18的活性成分纳入后续研究。

1.3 作用靶点收集和网络构建

通过TCMSP数据库收集活性成分的作用靶点，然后将作用靶点名输入UniProt数据库进行标准化。此外，在Genecards数据库中以“neuropathic pain”为关键词进行检索，获得潜在的“疾病靶点”。整合活性成分作用靶点和疾病靶点信息，得到交集靶点和瘀血痹胶囊活性成分-NP靶标调控网络。

1.4 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction,PPI）分析

在网络药理学研究中，STRING数据库通常被用来构建靶标蛋白之间的PPI网络。将经韦恩图处理后的交集靶点去重后导入到STRING数据库中，设置organism为“homo sapines”进行搜索，然后将处理好的数据导入Cytoscape 3.7.2软件中，利用该软件自带的Network Analysis插件进行网络拓扑分析，取靶点degree值的中位数构建PPI网络，并根据2倍degree值中位数筛选核心靶点。

1.5 GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析

对筛选所得交集靶点进行GO和KEGG富集分析，并对分子功能、生物过程和细胞成分3部分进行可视化，分析瘀血痹胶囊潜在的抗NP作用，同时获知瘀血痹胶囊产生抗NP作用的相关信号通路，分析其作用机制。

1.6 分子对接验证

将筛选所得核心靶点与瘀血痹胶囊活性成分-NP靶标调控网络中排名靠前的化合物进行分子对接。定义靶蛋白为受体分子，根据PDB数据库对该靶蛋白共晶小分子配体的文献说明，选择该靶蛋白特殊抑制剂（配体）作为活性中心，运用配体扩张法确定活性位点，即以共晶小分子配体的位置为中心，再向外扩增9 Å范围，这个范围的球状受体残基就构成了相关的活性位点，然后删除共晶配体以形成活性空腔。采用Discovery Studio 2019软件中LibDock模块进行模拟对接，以LibDockScore来评价化合物与靶蛋白的亲和力，其值越大，表明亲和力越高。

2 结果与分析

2.1 瘀血痹胶囊潜在的抗NP活性成分及其作用靶点筛选

检索、筛选后共得瘀血痹胶囊潜在的抗NP活性成分128个，作用靶点11 504个，去重后获得124个不重复作用靶点。与1 434个NP疾病靶点进行交集，得到43个交集靶点。

2.2 瘀血痹胶囊活性成分-NP疾病靶点网络构建

采用Cytoscape 3.7.2软件构建瘀血痹胶囊活性成分-潜在靶点网络图（图1，其中外圈为瘀血痹胶囊活性成分，中圈为瘀血痹胶囊作用靶点与NP疾病靶点的交集靶点，内圈为瘀血痹胶囊所含药味）。由图1可知，瘀血痹胶囊通过多活性成分、多作用靶点产生抗NP协同作用。对该网络进行进一步的Network Analyze分析，以活性成分的作用靶点个数为指标排序，获知槲皮素、山奈酚、木犀草素和4-亚甲基丹参新酮等可能为瘀血痹胶囊之所以具有抗NP作用的主要活性成分。

图1 瘀血痹胶囊活性成分-潜在靶点网络图

2.3 PPI网络构建结果

运用STRING数据库绘制交集靶点的PPI网络图（图2），然后采用Cytoscape 3.7.2软件筛选作用靶点，获知核心作用靶点为白介素-6、白蛋白、血管内皮生长因子A、胱天蛋白酶-3、丝裂原激活的蛋白激酶8、雌激素受体-1和β-淀粉样蛋白前体蛋白，主要集中于表皮/血管内皮细胞功能调节、炎症调控、白蛋白表达、细胞增殖/凋亡/分化、糖脂代谢和神经生长等方面。

图2 瘀血痹胶囊抗NP作用的PPI网络图

2.4 瘀血痹胶囊抗NP作用靶点的GO富集分析

对交集靶点进行GO富集-有向无环图分析，结果如图3所示，瘀血痹胶囊抗NP作用主要与核酸转录因子结合活性、跨膜受体活性、细胞分子功能、受体活性4大生物模块相关，通过调节肾上腺素受体活性、G蛋白偶联受体活性、甾体激素受体活性、神经递质受体活性、蛋白异二聚化活性和铵离子结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合、甾体激素结合过程，最终产生抗NP作用。

图3 瘀血痹胶囊抗NP作用靶点的GO富集条目有向无环图

2.5 瘀血痹胶囊抗NP作用的细胞内信号通路KEGG富集分析

以P值为标准选取与炎症、免疫、激素和中枢神经相关的20条信号通路进行可视化分析，其中与免疫和中枢神经相关的信号通路数较多，如神经活性配体-受体相互作用信号通路、神经退行性疾病途径-多种疾病信号通路、阿尔茨海默病信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、白介素-17信号通路、T细胞受体信号通路等；细胞的重要信号通路数也较多，如丝裂原激活的蛋白激酶8信号通路、环磷酸腺苷信号通路、钙信号通路等。KEGG富集分析显示，瘀血痹胶囊的活性成分可能是通过作用于上述诸信号通路而最终产生抗NP作用的（图4）。

图4 瘀血痹胶囊抗NP作用靶点的KEGG富集分析

2.6 分子对接验证

选取PPI网络图中大于2倍degree值中位数的核心作用靶点作为分子对接受体，同时选取瘀血痹胶囊活性成分-NP疾病靶点网络中排名前10位的化合物作为配体，进行分子对接。结果显示，这些化合物与白介素-6的对接活性最好，其次为白蛋白、血管内皮生长因子A、胱天蛋白酶-3、丝裂原激活的蛋白激酶8等作用靶点；木犀草素、异鼠李素、山奈酚等化合物与各核心作用靶点的分子对接得分均较高（平均值均＞100，表1）。此外，丹参中所含异隐丹参酮、丹参酮ⅡA、丹参酚醌Ⅰ、二氢丹参内酯等化合物均较好地结合在核心作用靶点的活性空腔内。

表1 瘀血痹胶囊主要活性成分与核心作用靶点的分子对接得分平均值

3 讨论

瘀血痹胶囊在治疗类风湿性关节炎时表现出有显着的镇痛作用，这可能与其含有乳香、没药、红花、丹参等镇痛药味有关。疼痛可分为伤害感受性疼痛和NP两类[10]。现代药理学研究显示，瘀血痹胶囊中的活性成分丹参酮ⅡA、迷迭香酸等对NP均有良好镇痛活性[11-12]。因此，运用网络药理学探究瘀血痹胶囊是否也具有抗NP作用是有一定理由的。

本研究运用网络药理学和分子对接技术研究发现，瘀血痹胶囊的主要作用靶点包括细胞因子（血管内皮生长因子A、白介素-6）、细胞核受体（雌激素受体-1、雄激素受体、过氧化物酶体增殖物激活受体）、功能调节蛋白（白蛋白、c-Fos蛋白、β-淀粉样蛋白前体蛋白）和酶（丝裂原激活的蛋白激酶8）等，这些作用靶点与神经活性、炎症和免疫功能等密切相关。GO和KEGG富集分析结果显示，瘀血痹胶囊系经影响神经活性配体-受体相互作用、肿瘤坏死因子、白介素-17、T细胞受体、丝裂原激活的蛋白激酶8、环磷酸腺苷、钙等信号通路而调节炎症、细胞增殖/分化/代谢和甾体激素、前列腺素等的受体活性，以及核酸复制、转录因子生成，最终产生抗NP作用的。

如前所述，丹参酚醌Ⅰ、二氢丹参内酯、丹参酮ⅡA和异隐丹参酮等均具有抗NP活性。分子对接结果也显示，这些化合物是瘀血痹胶囊之所以具有抗NP作用的重要活性成分。现代药理学研究显示，丹参中的活性成分丹酚酸B、丹参酚醌Ⅰ、丹参素、二氢丹参内酯、异隐丹参酮和丹参酮ⅡA等能通过可逆性地阻断神经干动作电位的冲动传导而产生抗NP作用[13]，没药、红花和川牛膝等中共有的活性成分槲皮素可通过显着降低肿瘤坏死因子-α、白介素-1β、诱导型一氧化氮合酶和环氧化酶-2等的表达水平而有效减轻NP[14]。此外，红花、香附和黄芪中共有的活性成分山奈酚能通过抑制Toll样受体4-核因子-κB信号通路，减弱caspase-8、caspase-3和NLRP1/NLRP3炎性小体的活性，减少或阻止炎症因子的产生，进而减轻脑神经细胞损伤，最终产生镇痛作用[15]。香附、黄芪等中共有的活性成分异鼠李素可通过抑制核因子-κB信号通路，降低肿瘤坏死因子-α、白介素-6和白介素-1β的表达水平，最终产生抗炎镇痛作用[16]；咖啡酸亦可通过抑制核因子-κB和5-脂氧合酶的活性，下调诱导型一氧化氮合酶的表达水平，减少一氧化氮合成，抑制炎症引起的髓过氧化物酶、丙二醛和亚硝酸盐水平的升高，抑制多种炎性介质的合成和释放，进而有效减轻炎症造成的神经元氧化损伤，最终产生炎性疼痛减轻作用[16-17]。

总之，网络药理学分析显示，瘀血痹胶囊具有多成分、多靶点、多途径治疗NP的潜力，其主要通过影响甾体激素受体活性、转录因子生成、炎症过程、神经细胞生长/修复等而产生抗NP作用。本研究结果为瘀血痹胶囊用于NP治疗提供了理论依据。