水母雪莲多糖对中波紫外线诱导的皮肤成纤维细胞凋亡的研究

孙楠 吴艳 姜莉

[摘要]目的：研究水母雪莲多糖对中波紫外线刺激下人皮肤成纤维细胞凋亡的影响及可能的机制。方法：利用蒸馏水回流提取+醇沉分离法提取水母雪莲中的多糖成分;使用包皮切除术后皮肤，处理后在6孔板中定量接种经10%胎牛血清DMEM培养基传代培养的细胞。细胞体外培养并分为空白对照组、紫外线照射组、10mg/ml水母雪莲多糖干预组和40mg/ml水母雪莲多糖干预组。除空白对照组外，其他组细胞分别在低辐射UVB（L-UVB，30mJ/cm2辐射1h）和高辐射UVB（H-UVB，60mJ/cm2辐射1h）两种条件下接受紫外线照射。在暴露于UVB光前，10mg/ml水母雪莲多糖干预组和40mg/ml水母雪莲多糖干预组细胞以终浓度为10mg/ml和40mg/ml水母雪莲多糖培养1h，紫外线组不干预。照射1h后，将细胞在37℃，10%胎牛血清DMEM培养基中温育18h。测定SOD、GSH、CAT及MDA水平，流式细胞术检测细胞凋亡，Western blot测定p38、p53、Bcl-2、Bax蛋白及caspase-3的β肌动蛋白含量变化。结果：水母雪莲多糖可以提高经中波紫外线损伤的成纤维细胞中SOD、CAT的活性和GSH含量，并可减少MDA含量，通过上调p38，p53和Bcl-2的表达，同时下调Bax和活性caspase-3的表达。与非干预组相比，无论暴露于低剂量还是高剂量辐射下，10mg/ml和40mg/ml水母雪莲多糖组的成纤维细胞凋亡数目都要更少。结论：水母雪莲多糖可以通过上调人成纤维细胞p38，p53和Bcl-2的表达、下调Bax和活性caspase-3的表达、增加SOD、CAT的活性和GSH的含量、减少MDA含量，从而抑制中波紫外线照射所致的细胞凋亡。

[关键词]水母雪莲多糖;中波紫外线;成纤维细胞;皮肤;诱导;凋亡

[中图分类号]R329.2+8    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2019）03-0100-04

Abstract： Objective  To investigate the effect of Saussurea medusa Maxim polysaccharides on apoptosis of human fibroblasts exposed to UVB and to study possible mechanisms. Methods  Distilled water was used for reflux extraction and alcohol precipitation filtration method was used to extract Saussurea medusa Maxim polysaccharides. After skin was removed by foreskin， treated with 10% fetal bovine serum DMEM medium and inoculated in 96-well plates and 6-well plates for later use. Cells were cultured in vitro and divided into blank control group， ultraviolet irradiation group， 10mg/ml jellyfish jellyfish intervention group， and 40mg/ml jellyfish polysaccharide intervention group. Each group of cells was exposed to ultraviolet light under two conditions of low-irradiation UVB （L-UVB， 30mJ/cm2 radiation 1h） and high-radiation UVB （H-UVB，60mJ/cm2 radiation 1h）. Before exposed to UVB light， cells of the experimental group were cultured for 1 hour at a final concentration of 10mg/ml and 40mg/ml Saussurea medusa Maxim polysaccharides. The UV group did not interfere， and the blank control group did not receive irradiation. After 1 hour of irradiation， cells were incubated in 10% fetal bovine serum DMEM medium for 18 hours at 37℃. The levels of SOD， GSH， CAT and MDA were measured. Apoptosis was detected by flow cytometry. The changes of β-actin in p38， p53， Bcl-2， Bax and caspase-3 were determined by western blot. Results  The Saussurea medusa Maxim polysaccharides can increase the activity of SOD， CAT and the content of GSH in fibroblasts damaged by UVB， and decrease the content of MDA. The expression of p38， p53 and Bcl-2 was up-regulated， and the expression of Bax and active caspase-3 was down-regulated at the same time. No matter when exposed to low or high doses of radiation， the number of fibroblasts apoptosis in 10mg/ml and 40mg/ml Saussurea medusa Maxim polysaccharides group was lower than that in the control group. Conclusion  Saussurea involucrata can up-regulate p38， p53 and Bcl-2， down-regulate the expression of Bax and active caspase-3， and inhibit the expression of MDA by increasing SOD activity， GSH content， CAT activity and reducing MDA content. Irradiation leads to apoptosis of fibroblasts.

Key words： Saussurea medusa Maxim polysaccharides; medium wave ultraviolet; fibroblast; skin; induction; apoptosis

紫外线（UV）照射被认为在光老化和皮肤癌的发生中发挥重要作用[1]。中波紫外线（UVB，290～320nm）可以透过表皮而影响真皮浅层，是自然环境中引起皮肤光损伤和光老化的重要因素之一，其主要靶细胞是成纤维细胞[2]。既往许多研究已经表明皮肤受大量紫外线照射后会引起诸多损害，如DNA/RNA损害[3]，丝裂原活化的蛋白激酶活化（MAPK）信号传导级联[4]，生产活性氧（ROS）[5]。经紫外线照射后，皮肤成纤维细胞的生长分化和功能等会发生明显改变，并能够增加成纤维细胞凋亡[6]。

水母雪莲（Saussurea medusa Maxim）为菊科凤毛菊属的一种高山草本植物，是一种传统中药[7]。水母雪莲具有除寒、壮阳、通经活血、清除自由基、抗疲劳及调节免疫功能等作用[8]，被广泛用于类风湿性关节炎，胃痛，痛经等疾病的治疗中[9]。水母雪莲多糖中的多糖主要含有七种单糖：木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖，半乳糖醛酸和甘露糖，对阴离子自由基和羟基自由基具有明显的清除作用[10]。研究表明[11]，水母雪莲中多糖成分具有抗氧化作用，可提高小鼠组织中SOD活性和谷胱甘肽（GSH）含量，降低丙二醛（MDA）含量。本研究旨在研究水母雪莲多糖对中波紫外线诱导的人成纤维细胞凋亡的影响及可能的机制，以提升皮肤的保护作用。

1  材料和方法

1.1 水母雪莲多糖的提取：使用80%乙醇溶液提取已经除去小分子糖类的干燥药渣。以10倍于药渣质量的蒸馏水回流提取3次，每次2h，提取完成后立即过滤，混合滤液后，减压蒸发溶剂至适当体积。再使用活性炭进行热回流脱色处理，加入乙醇，至乙醇终浓度为60%，冷藏条件下醇沉24h，离心得到浅黄色沉淀物粗多糖。加入无水乙醇至乙醇浓度为80%，继续进行24h低温醇沉，离心并收集沉淀物。使用蒸馏水再次溶解醇沉产物，使用Sevag法除去蛋白，确保终产物的茚三酮反应及碘反应均阴性。再次通过醇沉，获得灰白色的多糖，经有机溶剂洗涤除杂，真空干燥后妥善保存。

1.2 主要材料和试剂：10%胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），达尔伯克氏改良伊格尔（Dulbeccos Modified Eagles Medium，DMEM）培养基（美国Gibco公司）。SOD、GSH、MDA、CAT试剂盒;p38、p53、Bcl-2、Bax蛋白、caspase-3的β肌动蛋白Western blot试剂盒均购置于中山金桥生物科技有限公司。流式细胞术检测试剂盒来自BD公司。1 000W UVB辐照灯购置于上海Sigma-Aidrich贸易有限公司。

1.3 细胞培养和分组：取笔者医院泌尿科包皮切除术后皮肤，制成皮片后碘伏浸泡，再使用含青霉素（1×106U/L）、链霉素（100mg/L）的生理盐水溶液漂洗，加入Dispase酶分离真皮及表皮，并除去表皮组织。剪碎真皮后37℃环境下以0.25%胰蛋白酶+0.1%乙二胺四乙酸再次消化分散细胞5min，采用200目尼龙网过滤溶液。在6孔板中定量接种经10%胎牛血清DMEM培养基传代的细胞。

细胞体外培养并分成空白对照组，紫外线照射组，10mg/ml水母雪莲多糖干预组，40mg/ml水母雪莲多糖干预组。每组细胞分别在低辐射UVB（L-UVB，30mJ/cm2辐射1h）和高辐射UVB（H-UVB，60mJ/cm2辐射1h）两种条件下接受紫外线照射。在暴露于UVB光前，实验组细胞以终浓度为10mg/ml和40mg/ml水母雪莲多糖培养1h，紫外线组不干预，空白对照组不接受照射。照射1h后，将细胞在37℃，10%胎牛血清DMEM培养基中温育18h。

1.4 SOD，GSH，CAT和MDA水平的测定：在包含10%胎牛血清的DMEM培养基中孵育18h后，按SOD试剂盒，GSH试剂盒，MDA试剂盒和CAT试剂盒使用说明书，分别测量相应化合物活性或浓度。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡：所有细胞在37℃和5% CO2下孵育，细胞在6孔板进行消化并用PBS洗涤，调整细胞浓度为106。离心后弃上清液。加入100μl膜联蛋白结合缓冲液，细胞用5μl膜联蛋白和1μl PI工作液孵育15min。使用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙锭（PI）染色。用UV照射和LUT孵育之后，收集细胞并用冰冷的PBS洗涤2次，然后与膜联蛋白V-FITC和PI一起温育。使用流式细胞仪以480nm的激发波长通过FL-1滤膜（530nm）和FL-2滤膜（585nm）将细胞悬浮并进行流式细胞术检测。

1.6 Western bolt：依照说明使用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离裂解培养基，并将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，3%牛血清白蛋白封闭膜，在4℃下与第一抗体一起温育过夜，然后在室温下与辣根过氧化物酶标第二抗体温育2h。使用化学发光试剂盒检测p38、p53、Bcl-2、Bax蛋白、caspase-3的β肌动蛋白条带，使用Image J 5.0软件暴露于X射线胶片，测定密度。

1.7 统计学处理：SPSS 18.0统计学软件进行分析，所有数据均以平均值±标准差（x?±s）表示，行t检验和单因素方差分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2  结果

2.1 各组细胞SOD，GSH，CAT和MDA水平变化：与H-UVB组相比，L-UVB组SOD活性、GSH含量及CAT活性均显着降低，MDA含量明显增高（P<0.05）;10mg/ml多糖，40mg/ml多糖组的SOD活性，GSH含量及CAT活性均显着升高，MDA含量显着降低（P<0.05）;与10mg/ml多糖组比较，40mg/ml多糖时SOD活性，GSH含量和CAT活性显着增加，MDA含量显着降低（P<0.05）。各组SOD活性、GSH含量、CAT活性及MDA含量见图1。

2.2 成纤维细胞凋亡水平测定：在低剂量和高剂量的UVB紫外线辐射下，与非药物干预组相比，10mg/ml多糖和40mg/ml多糖组细胞凋亡细胞数量下降。见图2。

2.3 Western bolt结果：与对照组相比，L-UVB组p38，p53和Bcl-2的表达显着降低，Bax和活性caspase-3的表达显着增加（P<0.05）;与UVB组比较，10mg/ml Bcl-2的表达显着增加，Bax和活性caspase-3的表达显着降低（P<0.05）。然而，与UVB组相比，10mg/ml时p38和p53的表达降低（P>0.05）;与UVB组相比，40mg/ml时p38，p53和Bcl-2的表达显着增加，Bax和活性caspase-3的表达显着降低;与10mg/ml组相比，40mg/ml组p53表达显着增加，Bax表达显着降低（P<0.05）。在H-UVB组，p38、p53和Bcl-2的表达显着下降，Bax和活性胱天蛋白酶-3的表达与对照组相比显着增加（P<0.05）;10mg/ml和40mg/ml组p53和Bcl-2的表达显着增加，p38，Bax和活性caspase-3的表达显着降低（P<0.05 ）;与10mg/ml组比较，40mg/ml组Bcl-2表达显着增加，p38，p53，Bax和活性caspase-3表达显着降低（P<0.05）。各组中的p38，p53，Bcl-2，Bax和caspase-3的Western blot结果，见图3。

3  讨论

3.1 作为人体最大的器官，皮肤是机体固有免疫的重要组成部分，也是抵抗外界损害的第一道防线[12]。UVB照射通过产生ROS，诱导皮肤的氧化应激反应，导致细胞的抗氧化剂耗尽损伤皮肤组织和细胞组分（如脂质膜，蛋白质损伤和DNA），并可通过一系列机制导致细胞凋亡。CAT和SOD构成的酶促抗氧化防御系统，GSH蛋白通过减少最常见的自由基MDA引起的光老化来修复皮肤[13]。因此，笔者使用SOD活性，GSH含量，CAT活性和MDA含量作为这种损伤的指标来评估UVB照射后成纤维细胞的损伤程度。本研究发现，相比于单纯紫外线照射组，水母雪莲多糖增加了实验组细胞的SOD活性，GSH含量，CAT活性并减少了MDA含量。这些结果表明，水母雪莲多糖对UVB辐射的人成纤维细胞中的氧化损伤具有保护作用。

3.2 作为细胞受控的、程序性的死亡，凋亡对于生物体本身的生长发育和生命延续具有非常重要的生理意义。生物体可以通过凋亡的激活来清除老化或受损的细胞器及蛋白质，从而使生物体获得更新[14]。生物体凋亡不足或过于激活都可能会导致某些疾病的产生和发展。以往研究证明，ROS在UVB处理的角质形成细胞中的积累可促进细胞凋亡，导致线粒体通透性转换[15]。研究中也发现水母雪莲多糖可以通过上调p38，p53和Bcl-2的表达，同时下调Bax和活性caspase-3的表达来抑制中波紫外线照射导致的成纤维细胞凋亡增加。

3.3 目前已报道了许多天然植物成分对UV和氧化应激损伤保护作用的相关研究。例如，在绞股蓝中大量存在的绞股蓝总皂苷，对紫外线A和UVB诱导的损伤具有光保护作用[16]。用白杨素预处理可以有效防止紫外线诱导的损伤，甚至可以减少细胞凋亡，ROS产生和环氧合酶2（COX-2）的表达[17]。这些提示人们应重视植物成分对紫外线光损伤和光老化的保护作用，充分挖掘传统中医药宝贵财富。本项研究中对水母雪莲多糖减少中波紫外线诱导成纤维细胞凋亡的作用机理研究还不够深入，笔者将在后续的工作中继续研究。

4  结论

水母雪莲多糖可以通过上调p38，p53和Bcl-2，下调Bax和活性caspase-3的表达并可以通过提高SOD活性，GSH含量，CAT活性及降低MDA含量来抑制中波紫外线照射导致的成纤维细胞凋亡。

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[收稿日期]2018-11-26

本文引用格式：孙楠，吴艳，姜莉.水母雪莲多糖对中波紫外线诱导的皮肤成纤维细胞凋亡的研究[J].中国美容医学，2019，28（3）：100-103.