二肽基肽酶-4在造血和移植中的作用

李德冠，孟爱民

中国医学科学院 北京协和医学院 放射医学研究所天津放射医学与核医学重点实验室，天津300192

造血系统是一个高度分化的系统，其中，造血干细胞 (hematopoietic stem cells，HSC)和造血祖细胞(hematopoietic progenitor cells，HPC)发挥重要作用。造血干祖细胞 (hematopoietic stem and progenitor cells，HSPC)主要受体液免疫调节，包括细胞因子、趋化因子以及刺激细胞增殖的正调控因子，如:促红细胞生成素、集落形成刺激因子 (colony-stimulating factor，CSF)和白细胞介素等。虽然大量研究已经阐明了这些调节因子在细胞和细胞内的作用，但对于这些因子在疾病或应激状态下的功能改变仍有待进一步研究。近来研究发现，二肽基肽酶 (dipeptidyl peptidase，DPP)-4能够作用于一些与造血系统调节有关的趋化因子、克隆刺激因子和白细胞介素因子，提示DPP-4抑制可在造血系统及移植过程中发挥重要作用。本文总结了DPP-4抑制在造血系统和骨髓移植中的作用研究进展。

DPP4的结构和分布

DPP-4是1966年 Hopsu-Havu等［1］在鼠肝脏组织匀浆中发现的一个蛋白酶、相对分子质量为110 000，是丝氨酸蛋白酶家族中的一种，分布于细胞表面，含有766个氨基酸，其三维晶体结构在2003年由Lambeir等［2］研究证实。DPP是丝氨酸蛋白酶家族的一个亚群，主要包括DPP-4、成纤维激活蛋白-α(fibroblast activation protein-α，FAP-α)、DPP-8 和 DPP-9，其作用底物仍有待进一步发现。DPP-4分为两种形式:一种可在细胞表面表达CD26;另一种为可溶性分子，缺少细胞内部分和转膜结构域，两种DPP-4均具有酶活性。DPP-4的活性部分是Asp—His—Ser节段，其活性体为二聚体，每个亚单位包含2个结构域，凡是结构的 N端为Xaa-Pro-或Xaa-Ala-的多肽都是 DPP-4发挥活性的主要底物［3-4］。

可溶性DPP-4存在于血清/血浆、脑脊髓液、关节液和精液中，具有跨膜结构的DPP-4则在多种组织的内皮和表皮细胞中表达，包括骨髓细胞、静脉血管、胃肠道、肝脏、胰腺、肺、肾脏、前列腺等。此外，DPP-4还在胚胎干细胞、HSC、HPC以及其他多种成熟血细胞中表达［5］。

DPP-4的抑制

目前全球已有西格列汀 (sitagliptin)、维格列汀(vildagliptin)、沙格列汀 (saxagliptin)、阿格列汀(alogliptin)、利格列汀 (1inagliptin)、吉格列汀(gemigliptin)和替格列汀 (teneligliptin)7种DPP-4抑制剂上市，其中，西格列汀、维格列汀和沙格列汀已在我国上市，阿格列汀和利格列汀已在我国提出临床申请，吉格列汀在我国由LG Life Sciences授权双鹤制药开发。这些DPP-4抑制剂主要作为治疗2型糖尿病的口服降糖药物，通过抑制活性胰高血糖素样肽-1(glucagon like peptide-1，GLP-1)的降解失活，提高其浓度，增强其生理作用，促进β细胞胰岛素的分泌、抑制α细胞的胰高血糖素分泌，改善胰岛功能的紊乱，同时没有增加体重和低血糖的风险，不良反应少见［6-7］。

对DPP-4的调节作用机制目前尚未明确。Khurana等［8］研究发现，给予HSPC组织因子途径抑制物 (tissue factor pathway inhibitor，TFPI)可有效抑制DPP-4活性，增加细胞对CXCL12(SDF-1)的趋化性，进而提高归巢和植入能力。对GPC3-/-小鼠的研究发现，其HSPC增殖能力增加，而HSC自我维持能力下降，骨髓细胞表现出DPP-4高表达，从而使进入循环的HSPC增加，骨髓中干祖细胞池数目降低。GPC1-/-小鼠未发现上述变化。这些结果证实，TFPI可通过磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3，GPC-3)抑制DPP-4的活性。

DPP4抑制对细胞移植的调节作用

Christopherson等［9］研究发现，DPP4在 G-CSF动员小鼠HPC中可发挥介导作用，并进一步证实DPP-4在小鼠HSC归巢和植入中起调节作用。此后，研究人员在子宫内HSC移植、逆转录HPC移植等多个实验中，均证实DPP-4可在造血细胞移植中发挥作用，抑制DPP-4有利于造血细胞的归巢和植入［10-12］。

Prabhash等［13］观察了CD26在肿瘤患者或捐赠者动员外周血干细胞中的表达，结果发现CD26的表达与白细胞植入效果相关，有作为植入早期检测指标的可能。植入缓慢一直是临床脐带血移植难以克服的巨大难题，因为这一过程中会降低HSPC数目。Farag等［14］在临床造血疾病患者1个单位脐带血移植过程中使用了DPP-4抑制剂西格列汀，24例患者 (21～58岁)在接受清髓处理后，在-1 d到+2 d每天口服600 mg西格列汀，在第0天接受移植，临床监测获得较好的植入效果，中性粒细胞植入时间的中位数为21 d。该研究为临床脐带血移植时应用DPP-4提供了基础，利用西格列汀抑制DPP-4活性的剂量和时间仍有待进一步优化。而DPP-4抑制在其他如肌源性干细胞、原位单肺等移植中也有一定作用［15-16］。

DPP-4抑制对造血细胞的调节作用

Broxmeyer等［17］研究发现，DPP-4可调节 G-CSF功能影响造血系统，进而引发DPP-4在造血系统作用的关注。有研究显示，通过diprotin A(ILE-PRO-ILE)或缬氨酸-焦谷氨酸 (VAL-PYR)等多肽小分子抑制HSPC上DPP-4的活性，进而通过提高细胞对趋化因子CXCL12的趋化性，可提高HSPC的归巢和植入能力［18-19］。DPP-4剪切后的CXCL12缺失了趋化功能，但是能够抑制全长CXCL12发挥作用。Broxmeyer等［17］研究发现，接受DPP-4剪切后的细胞因子无论是在体内还是体外，其促进造血细胞的增殖能力都大幅下降，并会降低其相应全长因子的活性。而在DPP4-/-小鼠或者正常小鼠接受照射或者化疗前给予DPP-4抑制剂西格列汀，均有助于小鼠的造血系统恢复。现在临床上用于动员HSPC的G-CSF，其N末端起始位点是蛋氨酸，改变了原来的序列，进而能够逃过DPP-4的剪切。Christopherson等［20］则发现，来自脐带血、骨髓还是动员外周血的单个核血细胞都表达DPP-4，利用diprotin A处理过的细胞均能有效增加对趋化因子 CXCL12的趋化性。但在 CD26-/-小鼠和diprotin A预处理抑制DPP-4的小鼠中，G-CSF对造血细胞的动员能力反而下降，其机制有待进一步阐明。

巨核细胞可通过促血小板生成素受体 (antithrombopoietin receptor，c-MPL)直接影响HSC的静止或者通过分泌因子间接影响HSC的增殖与存活。而对DPP4-/-小鼠研究发现，尽管DPP-4敲除未对外周血计数产生明显作用。但在DPP4-/-小鼠骨髓中，无论是巨核细胞 (lin-CD41+CD61+)还是巨核祖细胞 (lin-CD41+CD61+C-kit+Sca-1-)的数目都有显着提高，提示DPP-4的缺失或者抑制有益于巨核细胞的发育，但机制尚未明确［21］。

DPP-4抑制对造血微环境的调节作用

造血微环境是HSC赖以生成的场所，造血细胞在微环境各种因素的调控下增殖、分化、发育及成熟。Ou等［22］利用NCBI数据库和通用蛋白资源 (universal protein resource，UniProt)寻找的氨基酸序列找到了近百个具有DPP-4切除位点的分子。这些分子有许多是能够调节造血细胞的趋化因子和生长因子，如成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor-2，FGF-2)、白细胞介素 (interleukin，IL)-5、IL-6、IL-17、CXCL12、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)等，这些因子均已有文献报道是存在于造血微环境或者被HSPC表达，能够调节造血系统的稳态。

Cho等［23］研究发现，甲状旁腺激素 (parathyroid hormone，PTH)能够刺激体外原代培养的成骨细胞和体内骨髓细胞高表达IL-6，IL-6进一步诱导成骨细胞释放转化生长因子-β，导致骨髓微环境中淋系细胞增加。Itikin等［24］研究发现，FGF-2体外处理可促进HSPC和基质细胞的繁殖。Krstic等［25］研究发现，IL17可刺激早期红系祖细胞的发育，通过p38MAPK通路抑制晚期红细胞生长。而IL-6/IL-17和FGF-2等因子都具有DPP-4的切除位点，提示DPP-4对造血微环境必有不可缺少的作用，但DPP-4对造血微环境的调节作用机制仍有待进一步探索。

总之，目前已经证实DPP-4抑制可通过提高细胞对趋化因子CXCL12的趋化性以及对细胞因子功能的调节在HSPC归巢和移植过程中发挥重要作用。DPP-4抑制不仅能够影响HSPC，还能影响造血微环境。但是由于大量细胞因子都具有理论的DPP-4剪切位点，一方面需要观察各类因子是否具有真正的DPP-4剪切位点，另一方面还要观察DPP-4剪切前后对细胞因子功能的影响。故DPP-4的调节作用机制仍有待进一步明确。

［1］Hopsu-HavuVK，Glenner GG.A new dipeptide naphthylamidase hydrolyzing glycyl-prolyl-beta-naphthylamide ［J］.Histochemie，1966，7(3):197-201.

［2］Lambeir AM，Durinx C，Scharpe S，et al.Dipeptidyl-peptidaseⅣfrom bench to bedside:an update on structural properties，functions，and clinical aspects of the enzyme DPPⅣ［J］.Crit Rev Clin Lab Sci，2003，40(3):209-294.

［3］Christopherson KW 2nd，Hangoc G，Mantel CR，et al.Modulation of hematopoietic stem cell homing and engraftment by CD26 ［J］.Science，2004，305(5686):1000-1003.

［4］Van der Veken P，Haemers A，Augustyns K.Prolyl peptidases related to dipeptidyl peptidaseⅣ:potential of specific inhibitors in drug discovery［J］.Curr Top Med Chem，2007，7(6):621-635.

［5］O’Leary H，Ou X，Broxmeyer HE.The role of dipeptidyl peptidase 4 in hematopoiesis and transplantation ［J］.Curr Opin Hematol，2013，20(4):314-319.

［6］陈卓，张庆文.DPP-4抑制剂研究进展 ［J］.上海医药，2013，34(7):50-55.

［7］Havale SH，Pal M.Medicinal chemistry approaches to the inhibition of dipeptidyl peptidase-4 for the treatment of type 2 diabetes［J］.Bioorg Med Chem，2009，17(5):1783-1802.

［8］Khurana S，Margamuljana L，Joseph C，et al.Glypican-3-mediated inhibition of CD26 by TFPI:a novel mechanism in hematopoietic stem cell homing and maintenance ［J］.Blood，2013，121(14):2587-2595.

［9］Christopherson KW 2nd，Cooper S，Broxmeyer HE.Cell surface peptidase CD26/DPPIV mediates G-CSF mobilization of mouse progenitor cells ［J］.Blood，2003，101(12):4680-4686.

［10］Peranteau WH，Endo M，Adibe OO，et al.CD26 inhibition enhances allogeneic donor-cell homing and engraftment after in utero hematopoietic-cell transplantation ［J］.Blood，2006，108(13):4268-4274.

［11］Tian C，Bagley J，Forman D，et al.Inhibition of CD26 peptidase activity significantly improves engraftment of retrovirally transduced hematopoietic progenitors［J］.Gene Ther，2006，13(7):652-658.

［12］Yoo E，Paganessi LA，Alikhan WA，et al.Loss of CD26 protease activity in recipient mice during hematopoietic stem cell transplantation results in improved transplant efficiency［J］.Transfusion，2013，53(4):878-887.

［13］Prabhash K，Khattry N，Bakshi A，et al.CD26 expression in donor stem cell harvest and its correlation with engraftment in human haematopoietic stem cell transplantation:potential predictor of early engraftment［J］.Ann Oncol，2010，21(3):582-588.

［14］Farag SS，Srivastava S，Messina-Graham S，et al.In vivoDPP-4 inhibition to enhance engraftment of single-unit cord blood transplants in adults with hematological malignancies［J］.Stem Cells Dev，2013，22(7):1007-1015.

［15］Parker MH，Loretz C，Tyler AE，et al.Inhibition of CD26/DPP-IV enhances donor muscle cell engraftment and stimulates sustained donor cell proliferation ［J］.Skelet Muscle，2012，2(1):4.

［16］Jungraithmayr W，De Meester I，Matheeussen V，et al.CD26/DPP-4 inhibition recruits regenerative stem cells via stromal cell-derived factor-1 and beneficially influences ischaemia-reperfusion injury in mouse lung transplantation ［J］.Eur J Cardiothorac Surg，2012，41(5):1166-1173.

［17］Broxmeyer HE，Hoggatt J，O’Leary HA，et al.Dipeptidylpeptidase 4 negatively regulates colony-stimulating factor activity and stress hematopoiesis［J］.Nat Med，2012，18(12):1786-1796.

［18］Paganessi LA，Walker AL，Tan LL，et al.Effective mobilization of hematopoietic progenitor cells in G-CSF mobilization defective CD26-/-mice through AMD3100-induced disruption of the CXCL12-CXCR4 axis ［J］.Exp Hematol，2011，39(3):384-390.

［19］ Hildebrandt M，Schabath R.SDF-1(CXCL12)in haematopoiesis and leukaemia:impact of D PPIV/CD26 ［J］.Front Biosci，2008，13(1):1774-1779.

［20］Christopherson KW 2nd，Frank RR，Jagan S，et al.CD26 protease inhibition improves functional response of unfractionated cord blood，bone marrow，and mobilized peripheral blood cells to CXCL12/SDF-1 ［J］.Exp Hematol，2012，40(11):945-952.

［21］Kidd S，Bueso-Ramos C，Jagan S，et al.In vivoexpansion of the megakaryocyte progenitor cell population in adult CD26-deficient mice ［J］.Exp Hematol，2011，39(5):580-590，e1.

［22］Ou X，O’Leary HA，Broxmeyer HE.Implications of DPP4 modification of proteins that regulate stem/progenitor and more mature cell types［J］.Blood，2013，122(2):161-169.

［23］Cho SW，Pirih FQ，Koh AJ，et al.The soluble interleukin-6 receptor is a mediator of hematopoietic and skeletal actions of parathyroid hormone ［J］.J Biol Chem，2013，288(10):6814-6825.

［24］Itkin T，Ludin A，Gradus B，et al.FGF-2 expands murine hematopoietic stem and progenitor cells via proliferation of stromal cells，c-Kit activation，and CXCL12 down-regulation［J］.Blood，2012，120(9):1843-1855.

［25］Krstic A，Kocic J，Ilic V，et al.Effects of IL-17 on erythroid progenitors growth:involvement of MAPKs and GATA transcription factors ［J］.J Biol Regul Homeost Agents，2012，26(4):641-652.