儿童心肌病的基因检测:我们究竟能从中获益多少?

(南京医科大学附属儿童医院心内科，江苏 南京 210019)

心肌病是一类严重威胁儿童健康和生命的心脏疾病，根据解剖和病理生理分型，可以分为扩张型心肌病(DCM)、肥厚型心肌病(HCM)、限制型心肌病(RCM)、致心律失常型右心室心肌病(ARVC)和左心室致密化不全(LVNC)等多种类型[1-2]。与成人相比，儿童心肌病在病因和临床表现等方面更加复杂，除了原发性心肌病外，还需注意遗传代谢性心肌病，如溶酶体病、线粒体心肌病(神经肌病)等。近年来，随着现代分子遗传学技术的发展和应用，心肌病的遗传学研究取得了巨大进展，并促进了人们对心肌病诊治模式理念的更新。目前，开展心肌病的基因检测、探索心肌病的精准诊断以指导治疗和危险分层管理，正逐渐被大家所认识和重视[3-6]。但如何在基因测序后获得的海量信息中识别出真正的致病突变，正成为我们面临的新的挑战，我们究竟能从中获益多少，值得我们认真思考。

1 儿童心肌病的遗传基础

1.1 HCM

HCM约占儿童心肌病的26%～42%，以常染色体显性遗传为主，家族性和散发性均有报道，两者具有相同的遗传因素。HCM遗传异质性强，可以存在不完全外显，但外显率随年龄增长而增加。目前发现的HCM致病基因有20多个，其中绝大部分突变位于肌小节蛋白(粗肌丝和细肌丝)基因，因此HCM也被称作“肌小节病”[7-10]。HCM相关基因主要有：β肌球蛋白重链基因(MYH7)和心肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC3)基因、编码粗肌丝蛋白基因[肌球蛋白重链基因MYH6、肌球蛋白轻链基因(MYL2、MYL3)]、编码细肌丝蛋白基因[肌动蛋白ACTC、原肌球蛋白TPMl、肌钙蛋T(TNNT2)、肌钙蛋白I(TNNI3)、肌钙蛋白C(TNNCl)]及装配蛋白基因(肌联蛋白TTN)。最近有报道在散发性HCM患者中发现了Z蛋白相关基因、钙离子相关蛋白基因和NEXN基因突变，但在人群中的突变频率低。

1.2 DCM

与HCM相比，DCM的病因更复杂，诊断原发性DCM，需排除炎症性心肌病、心动过速性心脏病及各种继发性因素。DCM有多种遗传方式，包括常染色体显性遗传、染色体隐性遗传、X连锁和线粒体遗传等方式，其中以常染色体显性遗传为主。目前发现的DCM致病基因约30多个，包括心肌肌节蛋白基因、Z盘蛋白基因、细胞骨架蛋白基因以及钙调控蛋白基因[11-13]，主要有LMNA、MYH7、TNNT2、SCN5A、DES、MYBPC3、TNNI3、TPMI、ACTC、PLN、LDB3以及TAZ等基因。近年来的测序发现DCM患者中存在较高频率的TTN基因突变[14]，但功能研究发现TTN可能发挥了基因修饰的作用。DCM某些特定的表型与特定的基因突变有关，如伴有传导障碍的DCM多数与核纤蛋白基因(LMNA)或SCN5A基因突变有关[15]；而伴随骨骼肌病变的DCM通常表现为X连锁遗传，多与肌营养不良蛋白(DMD)基因以及TAZ基因的变异有关。相对于HCM，DCM病人中候选基因突变检出率较低，不少病人存在多个基因的复合杂合突变，也存在不完全外显，是否与疾病相关还有待研究。

1.3 RCM

与DCM和HCM相比，原发性RCM发病率最低，但进展快、预后差，尤其是儿童RCM，确诊后平均生存期仅为2年。笔者诊治的10例RCM患儿，大部分死于确诊后1年。目前RCM发病机制仍不清楚，散发性RCM和家族性RCM均有报道，提示遗传因素可能发挥重要作用。近年来，通过对RCM患儿测序发现了较高频率的肌节蛋白基因(MYH7、TNNT2、TNNI3)突变，此外也发现了DES、TTN基因突变，提示肌节蛋白基因突变可能是RCM的重要遗传基础[5,16-19]。DES基因突变导致的RCM，多伴有高度房室传导阻滞或骨骼肌疾病。

1.4 ARVC

ARVC常以左束支阻滞的室性心动过速为特征，随着疾病的进展出现心力衰竭。ARVC发病与遗传关系密切，多呈常染色体显性遗传，30%～70%的ARVC患者与桥粒蛋白基因突变有关(如JUP、DSP、PKP2、DSG2及DSC2基因)，少数与非桥粒蛋白(TMEM43和TGFβ3)基因突变有关[3-5,20]，大多数基因具有显着等位基因异质性。儿童ARVC与成人ARVC具有相同遗传基础，但病例报道不多。

1.5 LVNC

LVNC发病机制尚不清楚，近50%的病例有家族史，其遗传方式多样化，包括常染色体显性或者隐形遗传、X连锁以及线粒体基因遗传等。目前发现约有15个基因参与了LVNC的发生，其中包括TAZ、ZASP/LBD3、LMNA以及DTNA等，同时还与MYH7、ACTC、TPM1、MYBPC、TNNT2、FKBP-12以及SCN5A基因的突变有关[3-5]。部分线粒体病，例如BARTH综合征等可以合并心肌致密化不全。

1.6 遗传代谢性心肌病

心肌病病儿，尤其婴儿期起病者，一定要注意遗传代谢性心肌病可能。此类患儿除心肌病变外，还可伴有血生化异常(肌酸激酶和肝酶升高、低血糖、高血脂、乳酸升高等)，另外还伴有代谢性酸中毒、肝脏肿大、神经肌肉受累等。相对于原发性心肌病，此类患儿通过基因检测对早期诊断意义重大，因为部分代谢性心肌病经过针对性治疗有可能逆转、阻止或延缓心肌病进展，改善预后[6,21]。

合并心肌肥厚的代谢性疾病主要有糖原累积病Ⅱ型、DANON病、PRKAG2心脏综合征等。糖原累积病Ⅱ型，又称POMPE病，常染色体隐性遗传病，因GAA酶基因突变引起酸性α-1-4葡萄糖苷酶缺乏导致糖原分解障碍，临床可表现为血清CK明显增高、肌肉无力、心肌肥厚等，婴儿期发病多以心肌肥厚为主要表现。DANON病是一种X连锁显性遗传性溶酶体病，由编码Ⅱ型溶酶体相关膜蛋白(LAMP2)的基因突变导致糖原代谢障碍，临床表现与DANON病类似，以肥厚型心肌病、骨骼肌病和智力障碍三联征为主要表现。PRKAG2心脏综合征为常染色体显性遗传，由编码AMP激活蛋白激酶r-2调节亚单位PRKAG2基因缺陷导致，临床表现为预激综合征、进展性传导系统疾病和心肌肥厚。

对儿童DCM合并血生化异常者，需注意脂肪酸代谢障碍(如肉碱缺乏症、肉碱棕榈酰基转移酶Ⅱ型缺乏症等)、氨基酸和有机酸代谢障碍(丙酸血症、甲基丙二酸血症、β-酮硫解酶缺乏症等)、溶酶体病、过氧化物酶体异常等遗传代谢性疾病；合并神经系统异常(智力发育落后、矮小、惊厥、共济失调等)，要考虑线粒体病可能。肉碱缺乏症，是脂肪酸氧化代谢病的常见病种，呈染色体隐性遗传，由于细胞膜上肉碱转运体OCTN2缺乏，从而导致肉碱摄取障碍及由尿液中大量流失而引起体内肉碱缺乏，影响脂肪酸代谢，多在2岁以前出现症状，临床表现为低酮性低糖血症、RYE综合征、昏迷、DCM、LVNC或者HCM、心律失常等。

法布里病(FABRY病)，为X连锁隐性遗传，主要为男性发病，女性杂合子表现轻微或无症状，由α-半乳糖苷酶缺乏导致其降解底物三糖苷神经酰胺在溶酶体内大量沉积所致，可表现为发作性肢体疼痛与四肢蚁爬感、皮肤血管角质瘤、肾脏病变，心脏主要表现为RCM或HCM表型。BARTH综合征是一种主要见于男孩的线粒体疾病，临床特点为肌无力、生长迟缓、周期性血清中性粒细胞减少和尿中3甲基戊烯二酸增多，心脏受累多表现为DCM或LVNC，也有呈HCM表现。此外，黏多糖病和先天性糖基化病，也可导致HCM或DCM。

2 如何开展儿童临床心肌病基因检测

既往多采用候选基因测序法，针对某一特定心肌病表型，检测1个或几个相关基因，费时、费力，突变阳性率低。即使基因检测阴性，也不能排除其他基因变异致病的可能。随着高通量二代测序技术的出现，人们设计出各种包含上百种心肌病相关基因的芯片，从而可以进行快速检测。

目前临床基因检测已受到社会和临床医师的广泛重视，出现了众多提供遗传检测服务的生物信息公司，少数大的医疗中心可以自行进行测序研究。根据需要，有多种检测策略可供选择，如HCM患儿合并肝脏肿大、血清CK升高、外周血白细胞GAA酶活性下降，可以直接选择单方向疾病检测方法检测GAA基因，以进一步确诊是否为POMPE病；对大多数心肌病病人，可选择涵盖目前已知与遗传性心肌病相关的所有基因的综合检测panel进行检测；如从科研考虑，可以选择全外显子测序，对涵盖目前人类已知2万个基因进行检测；对某些合并神经肌肉病变的心肌病患儿，除进行外显子组二代测序外，还需考虑拷贝数变异(CNV)和线粒体基因检测。在先证者发现阳性突变后，进一步对家系成员进行一代测序验证。

为提高分析能力，尽可能收集先证者家系成员资料，首先对先证者进行二代测序，发现可疑突变后，再进一步对家系成员进行一代测序验证；也可以直接选择对先证者核心家系Trio进行二代测序，再验证其他家族成员，这样能大大提高突变检测效率，但费用相对较高。

3 开展儿童心肌病基因检测的临床意义及精准诊治研究

由于儿童心肌病病因复杂，尤其是HCM和DCM，有时为多系统疾病的一部分，临床表现随病程发展而改变，仅依据刚起病时的临床特征难以诊断，开展临床诊断相对困难。传统诊断模式一般根据临床表现、实验室检查作出诊断，但对于部分早期临床表现不典型、无法确定病因的患儿，可以通过基因检测实现精准诊断。基因检测对合并心肌病变的遗传代谢性疾病的诊断有重要意义，因为此类疾病治疗方法与原发性心肌病差异巨大。如FABRY病，是GLA基因突变所致的一种X-连锁隐性遗传病，可通过补充α-半乳糖苷酶或转基因治疗。笔者近年来通过基因检测确诊了不少罕见的代谢性心肌病，如POMPE病、DANON病、先天性糖基化病(合并DCM)等，很好地指导了遗传咨询；其中对1例有特殊体征的“DCM”患儿通过基因检测发现IDUA基因突变，确诊为黏多糖病Ⅰ型，为IDUA基因突变引起α-L-艾杜糖醛苷酸酶缺乏，骨髓移植是治疗该病的主要手段。

目前世界范围内的研究者们都在利用遗传技术探索心肌病的精准治疗之路，2017年美国心脏协会(AHA)向世界各地的研究者开放了他们的精准医疗平台。对心肌病致病基因功能研究发现，突变主要是通过改变心肌纤维最大张力、对钙离子敏感性及能量代谢异常等影响心肌重构。如突变引起心肌细胞对钙离子敏感性增加、心肌最大张力和心肌收缩力增强，导致舒张功能的障碍，表现为HCM或RCM；相反，如突变引起心肌细胞对钙离子敏感性减弱、心肌最大张力和心肌收缩力下降，导致收缩功能障碍，表现为DCM。因此，开发高选择性的心肌球蛋白调节剂以及钙离子调节剂(增敏剂/减敏剂)有可能成为新的治疗手段。2017年8月MyoKardia公司宣布其研制的肌凝蛋白抑制剂mavacamten(MYK461)在PIONEER-HCM的二期临床试验显示能显着改善HCM舒张功能，证实MYK-461有潜力作为一种重要的新的治疗HCM的制剂[22]。

4 大数据下心肌病基因检测的思考

陈润生院士认为精准医学的核心“就是组学大数据和医学的结合”。二代测序的出现，让我们从测序技术时代，步入大数据分析时代，但也带来了新的挑战。一次基因组检测可以得到上百万个突变，但致病突变可能只有一个，如何解决海量数据临床级别分析成为关键。我们在临床实际应用中发现，遗传代谢性心肌病阳性检出率高，易于确诊和解释；而原发性心肌病，突变检出率相对较低，且存在不同程度的不外显率，不易解读[23-24]。

HCM作为典型的遗传性心血管疾病，并且是单基因心血管疾病中最为常见的疾病，最有可能实现精准医疗。DCM和其他分类心肌病病因复杂，相关基因众多，不少患者为非肌节蛋白基因突变，有的患者携带不止一个相关基因突变，即携带了复合突变、双突变甚至是三突变，数据不易解读，遗传诊断困难。携带多突变患者预后显着差于单突变患者。

5 展望

近年来遗传学技术的进步大大提高了我们识别儿童心肌病潜在病因的能力，但是由于儿童心肌病以散发为主，病因比较复杂，临床表型异质性强，疾病的进展、治疗和预后很难预测。如何对海量的测序信息和临床信息进行有效分析，成为我们新的挑战，也是开展精准诊治的关键。借助大数据技术，建立儿童心肌病的多中心联合研究，通过随访数据与临床数据、遗传检测数据的结合，深度分析儿童心肌病的发病因素及遗传背景、临床表型、诊断、用药、疾病演变及预后之间的关系，探索儿童心肌病的精准诊治，建立一套规范合理、易推广的儿童心肌病的长期管理方案，对提高我国儿童心肌病的诊治水平意义重大。