张婵娟 成 羿★ 董学亮
·基础研究·
轻揉推拿法对兔骨骼肌急性钝挫伤组织观察及IGFmRNA表达的影响
张婵娟成羿★董学亮
目的 探讨轻揉推拿法对骨骼肌钝挫伤修复的作用及其可能机制。方法 将27只实验兔随机分为创伤推拿组（观察组）和创伤对照组（对照组），每组各12只，另3只为正常组。采用“重物自由落体撞击法”制作实验兔骨骼肌急性钝挫伤模型。分别在3d、6d、10d、13d处死实验兔，每组每个时间点处死3只实验兔，每只实验兔在两条后腿致伤腓肠肌部位取标本，共计6个标本，采用光镜组织学观察评分、电镜超微结构观察和应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术对内源性胰岛素样生长因子（IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ）mRNA的测定，各组数据进行统计学处理。结果 光镜组织学观察评分：创伤推拿组伤后第6、10、13天与创伤对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。电镜超微结构观察结果创伤推拿组和创伤对照组在3d未见到肌卫星细胞，6d可见激活的肌卫星细胞，在10d和13d创伤推拿组肌组织趋于正常，创伤对照组有瘢痕形成；RT-PCR技术检测内源性胰岛素样生长因子（IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ）mRNA的表达量：各个时间点内与创伤对照组比较，创伤推拿组内源性的IGF-1和IGF-2的mRNA含量在3、6d与创伤组差异无统计学意义（P＞0.05）。观察组第10天开始，比创伤组高（P＜0.05）。结论 轻揉推拿法在中晚期可有效的改善兔骨骼肌钝挫伤后的组织学愈合过程和愈合质量。轻揉推拿法能促进骨骼肌钝挫伤后卫星细胞的激活，进一步促进新肌生成。轻揉推拿法在中晚期对内源性IGF-Ⅰ，IGF- Ⅱ的mRNA表达量上调有促进作用，从而可加强成肌细胞增殖。
轻揉推拿法 骨骼肌损伤 组织学 电镜 胰岛素样生长因子 肌卫星细胞
本实验自2009年10月至12月模仿临床轻柔推拿手法对实验兔腓肠肌钝挫伤的治疗。通过光镜观察组织学变化，电镜下观察肌肉组织的超微结构，以及应用RT-PCR技术对内源性胰岛素样生长因子（IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ）mRNA的测定，以了解轻柔推拿手法对骨骼肌损伤修复的进程和质量。探讨轻柔推拿手法对骨骼肌修复的可能机制。
1 材料与方法
1.1实验动物 中国大白兔27只，雌13只、雄14只，平均体重（2.5±0.2）kg，由浙江中医药大学动物实验中心提供。饲养及取标本皆在该中心完成。
1.2主要试剂 Trizol试剂（上海生工生物工程技术服务有限公司）。HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）。2×Taq MasterMix（含染料）酶（北京康为世纪生物科技有限公司）。100bp DNA Ladder Marker［TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司］。
1.3方法 （1）动物造模：参照张静［1］的模型，并稍加改进。制作过程：将实验兔俯卧位固定于解剖台，再褪去双后肢腿毛，利用重力棒，选定腓肠肌肌腹中段作为撞击中心，重物自由落体下落导致一次撞击伤，造成腓肠肌急性挫伤模型。（2）分组处理：将27只实验兔随机分为创伤推拿组（观察组）和创伤对照组（对照组），每组各12只，另3只为正常组。分别于3d、6d、10d、13d处死实验兔取标本。观察组：伤后第3天开始推拿，10～20min/d。推拿方法：在兔小腿三头肌处采用化瘀止痛轻揉手法：先用轻推法，以大拇指指端着力于跟腱，向腘窝方向进行直线推移。频率20次/min，持续5min。再用拇指揉法，持续5 min，频率为60～80次/min。最后用擦法，即用手掌的大鱼际做跟腱与腘窝间的来回摩擦，频率80～100次/min，持续5min。对照组仅予纱布包扎伤处。每个时间点每组处死3只实验兔，每只实验兔两条后腿挫伤处腓肠肌标本，计24份。分别做RT-PCR检测内源性IGF的mRNA、做组织学分析、电镜超微结构观察。
1.4引物设计与合成 检索 NCB I GenBank数据库中IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ全长基因序列，应用Pri mer p remier5.0软件设计出IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ基因引物以及内参GAPDH基因的上下游引物序列。引物均由TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司合成。
1.5统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以（）表示，组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验。。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1光镜组织学观察结果 参照文献评分标准［2］进行统计评分。对照组撞挫伤后3d，组织切片中均见表皮出血、坏死灶、炎症细胞浸润、肌纤维透明样变性，肌纤维间见水肿、炎症细胞浸润。6d后，表皮及皮下仍有出血、坏死及炎症细胞浸润，皮下水肿，肌纤维透明变性，其中组织内仍见出血灶、坏死、水肿、肌纤维透明变性。10d后，表皮及皮下仍有瘀血、坏死及炎症细胞浸润，皮下水肿，肌纤维透明变性，其中组织内仍见坏死、水肿、肌纤维透明变性。13d后，表皮及皮下仍有坏死及炎细胞浸润，皮下水肿，肌纤维透明变性，其中组织内仍见坏死、水肿、肌纤维透明变性。观察组造模后：第3天，有皮下水肿、出血、坏死、肌纤维透明变性。第6天，有皮下水肿、瘀血、坏死、肌纤维透明变性；组织内见纤维母细胞浸润，瘀血、水肿减轻。第10天，组织内见纤维母细胞浸润，水肿减轻，组织中可见部分肌纤维肿胀，偶见组织内有瘀血灶，胶原纤维增生。第13天，组织内见纤维母细胞浸润，水肿减轻，组织中可见到部分肌纤维肿胀，偶见组织内有瘀血灶，并可见血管、胶原纤维增生。皮下水肿、坏死、炎症细胞浸润已消失。见表1。
表1 镜下组织学结果比较（x±s）
2.2电镜观察结果 成模3d对照组肌纤维紊乱、崩解局灶坏死，Z线模糊糖元沉积，低剂量组损伤处肌纤维排列紊乱，Z线模糊，局灶性肌纤维溶解。观察组损伤处肌纤维结构紊乱、崩解、局灶坏死。伤后6d，对照组肌组织断裂处Z线紊乱，肌卫星细胞激活并向内移，伴有肌纤维溶解。观察组肌卫星细胞激活，并向短处内移，肌质网增生扩张，肌纤维再生。伤后10d对照组损伤处肌组织进一步溶解萎缩，逐渐被纤维胶原瘢痕组织替代。观察组损伤处有新生的肌纤维，并逐渐修复。伤后13d，对照组成纤维细胞，周围有糖原颗粒和胶原纤维，瘢痕形成，观察组损伤处局部紊乱肌纤维接近正常肌纤维。
2.3检测RNA表达结果 见表2、3。
表2 同一时间点内内源性IGF-Ⅰ的mRNA含量比较（x±s）
表3 同一时间点内源性IGF-Ⅱ的mRNA含量比较（x±s）
3 讨论
四肢软组织损伤处，施于揉法具有活血化瘀、通络舒筋、消肿止痛的作用，从而使气行则血行，血活则瘀去，瘀去则生新，损伤的组织即可得到修复［3］。骨骼肌损伤后恢复时间长，愈合质量不可靠，易反复再伤，迁延数年，直至肌肉变性和瘢痕形成。而通过轻柔推拿法作用于受损部位的体表和穴位，则能导致局部经络反应，激发和调整经气，疏通经络，同时增强气血生化和运行，起到祛瘀、消滞、生新的作用［4］，促进骨骼肌损伤后愈合。
该实验是模仿临床轻柔推拿手法对实验兔腓肠肌钝挫伤进行治疗。实验首先采用组织学观察的评分方法，作为治疗效果的指标，判断治疗效果准确性较高。采用经典的组织学评分方法，能较准确的表达推拿在组织学观察方面促进骨骼肌修复的作用，即评分越低其修复作用越佳。由于推拿在第3天后开始，观察组第3天与创伤组差异无统计学意义（P＞0.05），在第6、10、13天，观察组有明显差异（P＜0.05），表明推拿能有效的降低组织学评分，改善表皮出血、组织坏死灶、肌纤维透明样变性，肌纤维间水肿、炎细胞浸润等骨骼肌损伤和修复的组织学表现。
根据电镜超微结构观察结果显示，对照组损伤后3d肌肉表现为肌纤维排列紊乱、崩解、局灶坏死，Z线模糊糖元沉积，观察组可见损伤处肌纤维紊乱，Z线模糊，局灶性肌纤维溶解和对照组相似，这与推拿从第3天开始有关。伤后第6天对照组损伤处观察到肌卫星细胞，但是不如观察组，观察组卫星细胞激活，并向损伤处内移，肌质网增生扩张，肌纤维再生。伤后10d对照组损伤处逐渐被瘢痕组织替代，而观察组肌卫星细胞发育成新的成肌细胞，新的肌纤维替代损伤处。伤后13d时，对照组为瘢痕愈合，而观察组基本恢复正常。实验通过观察损伤处骨骼肌的电镜超微结构表明：推拿能够激活肌卫星细胞，促进骨骼肌损伤后愈合。
近年来开展的生长因子（GF）促进组织愈合研究［5～8］，在骨骼肌愈合方面已取得一些进展。在尚未发现特异性骨骼肌生长因子前，采用细胞培养加各种GF或损伤局部直接注射GF的动物实验已经证实胰岛素样生长因子（ICF-Ⅰ和IGF-Ⅱ）可以加强成肌细胞增殖，增加成肌细胞分化形成肌管，同时增强再生肌肉的收缩力和强直力，应用RT-PCR检测内源性IGF-I和IGF-Ⅱ的mRNA表达，可了解骨骼肌损伤后的愈合情况。
本资料显示，正常实验兔腓肠肌内源性IGFI的mRNA表达量较低，与对照组和观察组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。对照组随着时间点的不同，IGF-I的mRNA表达量有波动。第3天IGFI的mRNA表达量较正常组高，第6天达到峰值，第10天下降，第13天基本回到第3天水平，但是较正常组织高。观察组与对照组比较，第3、6天差异无统计学意义（P＞0.05），第10、13天差异有统计学意义（P＜0.05）。推拿能够上调兔急性钝挫伤腓肠肌局部的内源性IGF-I的mRNA表达量，因此推测通过上调局部内源性IGF-I mRNA是推拿促进骨骼肌愈合的途径之一，即推拿促进急性钝挫伤骨骼肌愈合的作用机制之一是使局部内源性IGF-I的mRNA表达上调，从而通过内源性IGF-I mRNA实现修复急性钝挫伤的骨骼肌组织。
根据实验检测内源性IGF-Ⅱ的mRNA表达，正常实验兔腓肠肌内源性IGF-Ⅱ的mRNA表达量极低，基本检测不到。对照组随着时间点的不同，IGF-Ⅱ的mRNA表达量有波动。第3天IGF-Ⅱ的mRNA表达量较正常组高，第6天达到峰值，第10天下降，第13天基本回到第3天水平，但是较正常组织高。观察组与对照组比较，第3天、第6天差异无统计学意义（P＞0.05），第10、13天差异有统计学意义（P＜0.05）。推拿能够上调实验兔急性钝挫伤腓肠肌局部的内源性IGF-Ⅱ的mRNA表达量，因此推测通过上调局部内源性IGF-Ⅱ mRNA是推拿促进骨骼肌愈合的另一途径和作用机制。
结合内源性IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ的mRNA检测结果、光镜组织学评分、电镜观察，观察组在治疗实验兔骨骼肌急性钝挫伤中后期效果明显。通过上调内源性IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ的mRNA表达量是推拿促进急性骨骼肌钝挫伤愈合的一种途径和机制。
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Objective To study the function of massage in recovery from blunt skeletal muscular contusion and its possible mechanism. Method 27 rabbits were randomly divided into the massage group，the trauma comparison group，each with 12 rabbits，and the normal comparison group with the other 3 rabbits. The model of acute blunt skeletal muscular contusion is made by using the “blow of heavy weight free falling”. Three rabbits from each group were put to death at each time point on the 3rd day，the 6th day，the 10th day and the 13th day，with 2 hind gastrocnemius muscles from each rabbit taken as specimens，6 specimens in total each time. By the observation and rating based on light microscopic histology，the observation of ultrastructure through electron microscopy，and by using the reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）technology to determine the endogenous insulin-like growth factor （IGF-Ⅰ，IGF-Ⅱ）mRNA，each set of the data is collected for statistical analysis. Results Based on light microscopic histological rating，it was statistically rewarding to compare the massage group on the 6th day，the 10th day and the 13th day after injury with the trauma comparison group （P＜0.05）. Based on ultrastructural electron microscopic observations，no muscle satellite cells were seen on the 3rd day both in the massage group and the trauma group. On the 6th day，more activated muscle satellite cells were seen. On the 10th day and the 13th day，the muscle tissue of the massage group tended to be normal，while scars were formed in the trauma group. By using the RT-PCR technology to detect the mRNA expression levels of endogenous insulin-like growth factors （IGF-Ⅰ，IGF-Ⅱ），a comparison with the trauma group within various time points showed that the massage group had equally the same endogenous IGF-1 and IGF-2 mRNA levels on the 3rd and the 6th day，which has no statistical signifi cance； while from the 10th day onwards，the massage group started to show higher levels than the trauma group （P＜0.05）. Conclusions Firstly，the effects of gentle massage at the intermediate and late stages after the rabbit’s blunt skeletal muscle contusion can effectively improve the histological healing process and healing quality. Secondly，the effects of gentle massage can promote the activation of satellite cells after blunt skeletal muscle contusion，thus further promoting new muscle formation. Thirdly，the effects of gentle massage at the intermediate and late stages can help increase the endogenous IGF-I and IGF-Ⅱ mRNA expression levels，which leads to the reproduction of muscle cells.
The effects of gentle massage Muscle damage Histology Electron microscopy Insulin-like growth factor muscle satellite cells
浙江省科技计划项目（2009C33100）
310007 杭州市中医院
