二甲双胍联合饮食干预对高脂饮食肥胖大鼠膝骨关节炎的影响

陈行尧 项佳 鲁琛

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是致残率高的慢性骨关节病。目前对骨关节炎的确切病因仍不清楚，其主要的相关致病因素有：年龄，肥胖，创伤，关节负重改变，感染，基因突变等［1］。随着人口老龄化及肥胖症患者人数逐年增多，肥胖和老龄化成为了OA发生发展主要的致病因素［2］。二甲双胍临床应用60余年，是全球应用最广泛的口服降糖药之一，其具有良好的单药/联合治疗降血糖作用。最近研究表明，二甲双胍具有抗OA作用，主要表现为保护软骨基质的降解、抑制软骨细胞的肥大分化、保持软骨细胞的正常生理功能、阻止软骨下骨的硬化及重塑［3］。并且，现代研究发现饮食干预可以调节膝关节的代谢及其炎症，从而起到改善膝关节骨关节炎症状的作用［4］。目前，研究表明二甲双胍和饮食干预都分别对OA具有一定的缓解作用，但两者联合干预对OA的影响未见报道。因此，本研究结合高脂高糖及Hulth法建立大鼠OA模型，并通过二甲双胍联合饮食干预探讨对肥胖型OA大鼠氧化应激及炎症因子分泌的影响，揭示二甲双胍联合饮食干预对肥胖型OA的辅助治疗作用，以期为临床护理OA患者提供一定的治疗方向。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 低温高速离心机来自Thermo公司；电泳仪电泳槽，转膜仪，化学发光仪均来自天能公司；全自动脱水机，石蜡切片机，烤片台，水浴缸，加热石蜡包埋系统，正置荧光显微镜均来自Leica公司。BCA蛋白定量试剂盒（批号：KGP903），化学发光检测试剂，预染蛋白marker均来自Solarbio公司；苏木素染液来自MDL公司；伊红染液来自珠海贝索生物技术有限公司。二甲双胍（货号B1970）购自美国APExBIO公司。水合氯醛（批号：MB4202）购自大连美仑生物技术有限公司。

1.2 实验动物 72只5周龄清洁级雄性SD大鼠，体质量（170~180）g，购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物许可证号：［SCXK（沪）2017-0005］。保持温度（22±2）℃，湿度50%~60%，在12 h昼夜节律的环境下自由饮水与进食，由浙江中医药大学实验动物中心饲养，实验方案经浙江中医药大学伦理委员会批准，批准号为 20210205。

1.3 实验方法 （1）动物分组及给药：72只SD大鼠随机选取分为6组：健康组、OA模型组、肥胖模型组、肥胖OA模型组、饮食干预组、饮食干预+二甲双胍组，每组12只。除健康组及肥胖模型组外，其余各组采用改良Hulth法建立膝骨关节炎大鼠模型，大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠（2 mL /kg），于大鼠左髌骨上方正中做一切口，切除内侧半月板及内侧副韧带。术后连续3 d予青霉素20万单位肌内注射以预防感染。术后1周，健康组及OA模型组给予常规饲料，肥胖模型组及肥胖OA模型组饲以高脂饲料（10%蛋黄、10%蔗糖、10%猪油、0.5%胆固醇）与糖水（10%蔗糖）；饮食干预组饲脱脂饲料与自来水；饮食干预+二甲双胍组饲脱脂饲料与自来水的同时，给予二甲双胍2 mg/kg灌胃，均连续干预3月。（2）一般生理学观察：每天早晚观察各组大鼠精神状态、行为活动状态、毛发状态。每日观察各大鼠饮食饮水及排泄等情况。（3）大鼠的体质量及BMI值的测定：饮食干预3个月后，称重并量取体长，计算体质量指数（BMI），BMI=体质量/身高的平方（kg/m2）。（4）大鼠自主活动，抓力及疼痛阀值的测定：饮食干预结束后，应用大鼠自主活动程序仪测定大鼠的自发活动并计数，当计算机进入测定程序后，将大鼠放入箱中自由活动，每个活动箱中1只，由计算机自动记录大鼠的活动情况。实验时，把每只大鼠依次放入活动箱内，3 min适应期后，记录每只大鼠5 min内的活动次数；抓力测定则是在饮食干预及联合二甲双胍干预结束后用抓力测定仪对老鼠进行抓力测试，多次测量，并记录最大值。饮食干预3个月后，进行大鼠疼痛阀值水平测量，使用Electric Von Frey电子测痛仪，大鼠足掌心部放置探头，然后缓慢加压至出现缩足或抬腿，为疼痛阈值表现。每只重复测量3次，每次间隔15 min，3次测量结果的平均值作为疼痛阈值。（5）ELISA法检测大鼠关节液中炎症因子的含量：各组大鼠以10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉后，注射器吸取膝关节关节液，用PBS按1∶9的比例稀释后，2,000 r/min离心10 min，取上清液，-20℃保存待测。TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、SOD、MDA、GSHPx表达水平检测，严格按照试剂盒操作说明进行，最后在酶标仪上检测并分析其含量。（6）肥胖型OA大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量测定：心脏采血后，使用3,500 r/min，离心机离心15 min后，分离出上层血清，保存待检。用全自动血生化仪对血样的血生化指标（TC、TG、HDL-C、LDL-C）进行分析。采用酶联免疫吸附试验检测Aggrecan、Collagan II水平。（7）HE法观察肥胖型OA大鼠膝关节病理的改变：10%多聚甲醛固定膝关节标本48 h，20% EDTA脱钙4周。常规石蜡包埋、切片。石蜡切片60℃烤箱20 min，二甲苯 I、II、III各5 min，无水乙醇，95%、85%、75%乙醇各 3 min，水洗，苏木素2 min，水洗，盐酸乙醇分化5 s，水洗，1%氨水返蓝30 s，伊红2 min，水洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。切片于光学显微镜下进行观察。（8）WB法检测肥胖OA大鼠膝关节中Nrf2、HO-1、NF-κB p65、IκBα蛋白表达：膝关节组织混合裂解液放入预冷的玻璃匀浆器中进行研磨，提取膝关节总蛋白，并采用BCA法检测蛋白浓度。取样本蛋白30 μg于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，随后转至聚偏二氟乙烯膜上。10%脱脂奶粉封闭，随后加入一抗Nrf2（1∶1,000）、HO-1（1∶2,000）、NF-κB p65（1∶1,000）、IκBα（1∶2,000）和β-actin（1∶10,000）稀释液，4℃条件下过夜孵育，TBST洗膜后，加入二抗（1∶5,000）室温孵育1 h后。ECL化学发光显色、拍照，并进行蛋白条带灰度检测。

1.4 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件。计量资料多组间用One-way-ANOAY单因素方差分析，组间比较采用LSD或SNK分析。方差不齐者采用Kruskal-Wallis H检验。所有数据以（）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般生理状态 健康组大鼠生长良好，精力旺盛，活动频繁，毛发顺滑有光泽。肥胖OA模型组大鼠精神萎靡，活动减少，毛发蓬松无光；饮食干预组和饮食干预+二甲双胍组较肥胖OA模型组，活动有一定程度的增加。

2.2 饮食干预联合二甲双胍对肥胖型OA大鼠体质量及BMI的影响 各组大鼠体长并无显着区别，肥胖模型组大鼠体质量相较于健康组有显着增加（P＜0.01）。饮食干预组，饮食干预+二甲双胍组大鼠与肥胖OA模型组比，体质量和BMI值均显着下降（P＜0.05）。见图1。

图1 各组大鼠的体质量，体长及BMI指数

2.3 饮食干预联合二甲双胍对肥胖型OA大鼠自主活动，抓力，疼痛阈值的影响 与健康组大鼠相比，OA模型组，肥胖模型组及肥胖OA模型组大鼠的自主活动次数，疼痛阀值和抓力均显着下降（P＜0.05）。与肥胖OA模型组大鼠相比，饮食干预组和饮食干预+二甲双胍组的自主活动次数，抓力和疼痛阀值有显着上升（P＜0.01），其中饮食干预+二甲双胍组的上升趋势更为突出。见图2。

图2 各组大鼠自主活动次数，抓力及疼痛阀值的比较

2.4 饮食干预联合二甲双胍对肥胖型OA大鼠脂代谢和Aggrecan、Collagan II水平的影响 与健康组大鼠相比，OA模型组大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量无显着变化，Aggrecan、Collagan II水平则显着下降（P＜0.01），肥胖模型组的TC、TG、LDL-C含量显着上升（P＜0.01），HDL-C 含量显着下降（P＜0.01），Aggrecan、Collagan II水平无明显变化，肥胖OA模型组大鼠的TC、TG、LDL-C含量显着上升（P＜0.01），HDL-C含量显着下降（P＜0.01），Aggrecan、Collagan II水平也显着下降（P＜0.01）。与肥胖OA模型组大鼠相比，饮食干预组，和饮食干预+二甲双胍组的TC、TG、LDL-C含量显着下降（P＜0.05），HDL-C 含量显着上升（P＜0.01），Aggrecan、Collagan II水平显着上升（P＜0.05）。见图 3。

图3 大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、Aggrecan及Collagan II的含量水平

2.5 饮食干预联合二甲双胍对肥胖型OA大鼠关节液TNF-α，IL-1β，IL-6，MCP-1含量水平的影响 与健康组大鼠相比较，OA模型组，肥胖模型组，肥胖OA模型组大鼠膝关节中的TNF-α，IL-1β，IL-6，MCP-1含量均有显着升高（P＜0.01）；与肥胖OA模型组大鼠相比，饮食干预组，饮食干预+二甲双胍组膝关节中TNF-α，IL-1β，IL-6，MCP-1的含量则均有明显下降（P＜0.01）。见图 4。

图4 大鼠膝关节液中TNF-α，IL-1β，IL-6，MCP-1的含量

2.6 饮食干预联合二甲双胍对肥胖型OA大鼠膝关节液的SOD，MDA，GSH-Px含量水平的影响 与健康组相比较，OA模型组，肥胖模型组，肥胖OA模型组大鼠膝关节中的SOD，GSH-Px含量显着下降（P＜0.01），MDA则显着上升（P＜0.01）；与肥胖OA模型组大鼠相较，饮食干预组，饮食干预组+二甲双胍组的大鼠膝关节中的大鼠膝关节中的SOD，GSH-Px含量显着上升（P＜0.01），MDA 则显着下降（P＜0.01）。见图 5。

图5 大鼠膝关节液中SOD，MDA，GSH-Px的含量

2.7 饮食干预联合二甲双胍对肥胖型OA大鼠膝关节病理的影响 健康组大鼠膝关节软骨细胞形态正常，排列紧密，软骨层厚度适宜，无软骨脱失现象，骨小梁结构与形态紧密正常。与健康组相比，OA模型组大鼠膝关节软骨表面明显缺损，软骨基质降解、软骨细胞丢失，蛋白聚糖降解，呈现典型OA退变。与OA模型组比较，肥胖模型组有轻微变化，肥胖OA模型组缺损最严重；与肥胖OA模型组比较，饮食干预组和饮食干预+二甲双胍组有所缓解，饮食干预+二甲双胍组比饮食干预组缓解更多。见图6。

图6 饮食干预联合二甲双胍对肥胖型OA大鼠膝关节病理的影响（HE染色×100）

2.8 饮食干预联合二甲双胍对肥胖型OA大鼠膝关节蛋白表达水平影响 与OA模型组相比，健康组膝关节组织中Nrf2、HO-1与IκBα蛋白的表达水平显着上升（P＜0.05），NF-κB p65蛋白的表达水平显着下降（P＜0.05），肥胖模型组膝关节组织中Nrf2、HO-1与IκBα蛋白的表达水平显着下降（P＜0.05），NF-κB p65蛋白的表达水平无显着变化（P＞0.05）；肥胖OA模型组膝关节组织中Nrf2、HO-1与IκBα蛋白的表达水平显着下降（P＜0.05），NF-κB p65蛋白的表达水平显着上升（P＜0.05）。与肥胖OA模型组相比，饮食干预组与饮食干预+二甲双胍组Nrf2、HO-1与IκBα蛋白的表达水平显着上升（P＜0.05），NF-κB p65蛋白的表达水平显着下降（P＜0.05）。见图7。

图7 大鼠膝关节中Nrf2、HO-1、NF-κB p65、IκBα蛋白表达水平的比较

3 讨论

OA是致残率较高的慢性骨关节病，其中以膝骨关节炎（kneeosteoarthritis，KOA）的发病率最高。KOA是一种以关节软骨基质崩解、减少、骨赘形成、滑膜无菌性炎症为特征的关节退行性疾病，其病变涉及整个滑膜关节，包括软骨、滑膜和软骨下骨［5］。流行病学调查表明，体质量指数与KOA的发生发展具有显着关系，同时，肥胖相关检测指标如血甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low density liptein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high density liptein cholesterol，HDL-C）可作为观测KOA的重要指标［6］。此外，研究表明炎性因子在KOA的疼痛发生过程中被认为是重要影响因素。TNF-α、IL-1β、IL-6是目前研究最为成熟的三种促炎细胞因子，其中IL-1β在骨关节炎发生发展过程中处于核心地位，进一步促进滑膜炎症发展，滑膜壁增生，从而促进KOA的进展。TNF-α与IL-1β具有相似的生物学作用，并且在KOA的发病中与IL-1β起着协同作用［7-8］。再者，NF-κB是与炎症因子产生、细胞增殖、细胞外基质交联和细胞凋亡密切相关的转录因子，参与多种炎症的信号转导［9］。同时，炎症经常伴随着大量自由基的产生，自由基与不饱和脂肪酸相互作用后产生的脂质过氧化物 MDA会使细胞膜流动性降低、通透性增加，膜功能受损［10］。SOD和GSH-Px则是人体内维持氧化还原平衡的一类重要的酶，其能够有效地抵抗氧化作用，防御氧化应激损伤。Nrf2则可以调节抗氧化剂蛋白的表达，从而防止因炎症引起的氧化损伤，当有氧化应激因素存在时，Nrf2的表达增加，在氧化应激因素消除后，Nrf2表达逐渐恢复。有效降低OA炎症因子的含量并减少氧化应激损伤，可改善KOA的发展［11］。二甲双胍作为安全，有效的口服降糖药之一，因具有良好的降糖效果及其减轻体质量和其他心血管危险因素的特点，成为众多糖尿病指南推荐的T2DM一线治疗药物［12］。随着更多临床应用数据的获得，表明二甲双胍具有广泛的药理作用，如调血脂、治疗多囊卵巢综合征和非酒精性脂肪肝等［13］。现代研究发现，二甲双胍除了可以抑制胆固醇的生物合成和贮存，从而降低TG、TC水平［14］，还对OA具有双重保护作用。OA早期，二甲双胍能延缓软骨细胞老化。OA晚期，二甲双胍能促进软骨细胞自噬，避免OA病程的进展［15］。

本研究结果表明，饮食干预及饮食干预联合二甲双胍可显着降低大鼠血脂指标，膝关节中炎症因子TNF-α，IL-1β，IL-6，MCP-1，MDA的含量，并上调膝关节中SOD，GSH-Px含量。此外，饮食干预联合二甲双胍显着促进膝关节中Nrf2、HO-1与IκBα的蛋白表达，而抑制NF-κB p65蛋白表达水平。综上所述，饮食干预联合二甲双胍可能通过改善炎症，减轻肥胖程度，从而改善高脂饮食介导的膝骨关节炎。