脑卒中血清培养骨髓间质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注的影响

贾韩静 童一心 黄哲华*

脑卒中在老年人群中较为常见，具有高发病率和高死亡率特点，其中87%为缺血性脑卒中，目前青年缺血性脑卒中的发病率已明显增加［1］。间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSCs）来源广泛，有高度自我更新和多态分化能力，已被应用于脑卒中移植治疗以改善神经功能［2］。但MSCs 移植的成功率较低，因此提高MSCs 细胞移植后的活力已成为MSCs 移植治疗脑卒中的研究重点［3］。研究发现，MSCs 经中风患者血清培养后移植可提高MSCs 的治疗效果［4］。基于此，本研究通过建立大鼠中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，探讨缺血性脑卒中血清预处理的MSCs对MCAO 大鼠的神经保护效果及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 85 只健康SD 大鼠，体重250～280 g，购于上海吉辉实验动物饲养有限公司［SCXK（沪）2017-0012）］，饲养于杭州鹰旸生物科技有限公司动物中心［SYXK（浙）2020-0024）］。

1.2 材料与仪器 苏木素染液（货号：MD911467）购于MDL；伊红染液（货号：613101）购于珠海贝索生物技术有限公司；Tunel 试剂盒（货号：11684817910）购 于Roche；CD44、CD90、CD45抗 体（货 号：85-12-0444、85-11-0900、85-11-0461）购于eBioscience；CD34抗体（货号：AF6518）购于R&D；脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）ELISA 试剂盒（货号：MM-0209R1、MM-0187R1、MM-0152R1、MM-0179R1）购于酶免。Brdu 抗体（货号：Ab8152）购于Abcam，BDNF、NGF 抗体（货号：DF6387、DF6061）购于Affnity。C6 流式细胞仪（BD）；Micro 17R 高速离心机（Thermo），Nikon DS-U3 成像系统（日本尼康）。1.3 方法 （1）骨髓MSCs 的分离与培养：从大鼠股骨中抽取骨髓，淋巴细胞分离液密度梯度离心分离法分离单核细胞。用10% 胎中血清（FBS）和含有1%双抗（penicillin/streptomycin）的DMEM 培养基培养分离的单核细胞并传代2 次获取MSCs。（2）流式细胞术检测CD44、CD90、CD34、CD45抗原表达：PBS 清洗MSCs，离心，适量PBS 重悬底部细胞，调整浓度为5×106～10×106/mL。吸取100μL 细胞悬液与流式管内，各加抗体5 μL，混匀后室温避光孵育15 min。清洗细胞（同上），500μL PBS 重悬细胞，流式上机检测。（3）缺血脑组织预处理MSCs：分离5 只缺血性脑卒中大鼠和5 只正常大鼠血清，离心10 min 后分离上层液。脑卒中大鼠血清与细胞培养液混合后培养MSCs，标记为SS-MSCs，正常大鼠脑组织血清与细胞培养液混合后培养MSCs，标记为NS-MSCs；FBS 培养的MSCs，标记为FBS-MSCs。（4）MCAO 大鼠模型的制备与分组：10%戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠，采用Zea Longa 线栓法制作MCAO 大鼠模型［5］。造模1 d 后，预处理MSCs 经Brdu 荧光染色后静脉注射到大鼠尾静脉中，随机分为MCAO 组（等体 积PBS）、MCAO+FBS-MSCs 组（2×106cells FBSMSCs）、MCAO+NS-MSCs 组（2×106cells NS-MSCs）、MCAO+SS-MSCs 组（2×106cells SS-MSCs），同时sham组注射等体积PBS。（5）MCAO 大鼠行为变化的监测：MCAO 大鼠尾静脉注射移植预处理的MSCs 第1、7、14天后观察其行为变化，采用贴纸试验（Adhesive-removal test）、改良神经功能缺损评分（modified neurological severity score，mNSS）进行评估。mNSS 评判标准：轻型受损1～6 分；中型受损7～12 分；重型受损13～18 分。（6）TTC 染色：MSCs 移植14 d 后，麻醉处死大鼠，摘取脑组织，于-20 ℃冰箱冻存5 min，取出后称重。将大鼠脑组织按1～2 mm 厚度切下5～6 片，TTC 溶液染色，37℃孵育15 min，4%多聚甲醛固定30 min，拍照；梗死区呈白色，正常区呈红色，图像处理和分析软件处理以计算脑梗死面积占比（%）=脑梗死区面积/脑组织总面积×100%。（7）HE 染色：石蜡包埋脑组织，常规切片，烤片，脱蜡至水。按步骤进行HE 染色。同时行HE 半定量分析，0 分为无炎症细胞浸润、无神经元萎缩，1～4 分分别为炎症细胞浸润范围、神经元萎缩面积＜25%、25%～50%、＞50%～75%、＞75%。（8）Tunel染色：标本制作同上。蛋白酶K 修复工作液和破膜工作液预处理标本。滴加TdT 与dUTP，37℃孵育2 h，避光室温加入DAPI 复染细胞核10 min，PBS 洗涤，抗荧光淬灭封片剂封片，倒置荧光显微镜下观察并采集图像以分析脑组织中细胞凋亡情况。阳性凋亡细胞核呈绿色。（9）ELISA 检测：参照相关试剂盒说明，ELISA检测大鼠脑组织BDNF、NGF、HGF、VEGF 等生长因子或营养因子的表达水平。（10）免疫组织化学染色：MCAO 造模后，大鼠腹腔内定时注射50 mg/kg BrdU 连续3 d，14 d 后取脑组织行冠状组织制备冷冻切片。按试剂说明书行免疫组织化学和DAPI 双重染色。20 倍、40 倍显微镜下选取连续6 个视野计数阳性细胞。

1.4 统计学方法 采用SPSS 16.0 统计软件。符合正态分布计量资料以（±s）表示，多组间比较用方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MSCs 的形态学特征 原代MSCs 经过24 h 培育后，可见单个黏附贴壁细胞，呈纺锤状或多边形（见图1A）；3～5 d MSCs 细胞迅速增殖所示，可见梭形、多突状的成纤维样克隆细胞（见图1B）。

图1 骨髓间质干细胞的形态学特征

2.2 MSCs 细 胞 表 面 标 志 物CD44、CD90、CD34、CD45的表达 MSCs 细胞表面CD44和CD90分子阳性率达到92.17%±0.51% 和95.50%±0.95%；而CD34和CD45分子阳性率仅为1.31%±0.09%和1.95%±0.07%。见图2。

图2 MSCs细胞表面标志物CD44、CD90、CD34、CD45表达

2.3 MCAO 大鼠行为变化的情况 MSCs 移植第0、1 天各组大鼠贴纸去除时间和mNSS 评分差异均无统计学意义（P＞0.05）。从MSCs 移植后第7 天开始，MCAO+FBS-MSCs 组、MCAO+NS-MSCs 组 与MCAO+SS-MSC 组大鼠的双侧贴纸去除时间、mNSS评 分 较MCAO 组 均 降 低（P＜0.05 或P＜0.01）；与MCAO+FBS-MSCs 组比较，MCAO+SS-MSC 组大鼠贴纸去除时间、mNSS 评分降低（P＜0.01）；与MCAO+NSMSCs 组比较，MCAO+SS-MSC 组大鼠贴纸去除时间、mNSS 评分降低（P＜0.01）。见图3。

图3 MCAO大鼠行为变化的情况 A：注射预处理MSCs第0、1、7、14 天后的贴纸试验结果；B：注射预处理MSCs第0、1、7、14 天后mNss评分结果

2.4 TTC 染色观察MCAO 大鼠脑梗死面积 与sham 组比较，MCAO 组大鼠脑梗死面积极升高（P＜0.01），与MCAO 组比较，MCAO+FBS-MSCs 组、MCAO+NS-MSCs组与MCAO+SS-MSC 组大鼠脑梗死面积降低（P＜0.05或P＜0.01）；与MCAO+FBS-MSCs 组比较，MCAO+SSMSC 组大鼠脑梗死面积降低（P＜0.01）；与MCAO+NSMSCs 组比较，MCAO+SS-MSC 组大鼠脑梗死面积降低（P＜0.01）。见图4。

图4 A. MCAO大鼠脑梗死面积（TTC染色×400）；B. 预处理MSCs对MCAO大鼠脑梗死率的影响

2.5 HE 染色观察MCAO 大鼠脑组织恢复情况 sham组大鼠脑组织神经元染色正常，结构清晰，排列致密有序。MCAO 组脑组织结构疏松，着色变浅，神经细胞层次改变，可见明显细胞碎片及组织空泡样改变，HE 半定量评分较sham 组升高（P＜0.01）。与MCAO 组比较，预处理MSCs 组神经元数目增加，空泡样改变减弱，且神经元损伤性病理变化减轻，大鼠脑组织HE 半定量评分均降低（P＜0.05 或P＜0.01），其中MCAO+SS-MSCs 损害程度最低，接近于sham 组。见图5。

图5 A. MCAO大鼠脑组织恢复情况（HE染色×400）；B. MCAO大鼠脑组织HE半定量评分

2.6 Tunel 染色观察脑组织中细胞凋亡情况 与sham组比较，MCAO 组脑组织细胞凋亡率升高（P＜0.01）。各预处理MSCs 组较MCAO 组凋亡率均显着减少（P＜0.05 或P＜0.01），其细胞凋亡程度由低到高依次为：MCAO+SS-MSC 组＜MCAO+FBS-MSCs 组＜MCAO+NSMSCs 组。见图6。

图6 A. MCAO大鼠脑组织细胞凋亡表达情况（Tunel染色×400）；B. MCAO大鼠脑组织细胞阳性凋亡率

2.7 预处理MSCs 对大鼠脑组织中BDNF、NGF、HGF、VEGF 水平影响 与sham 组比较，MCAO 组脑组织中BDNF 水平升高（P＜0.01），VEGF 水平降低（P＜0.05）；与MCAO 组比较，MCAO+FBS-MSCs 组BDNF、HGF、VEGF 水平高（P＜0.05、P＜0.01），BDNF、NGF、HGF、VEGF 水平在MCAO+NS-MSCs 组与MCAO+SS-MSC 组均升高（P＜0.05、P＜0.01）；与MCAO+FBS-MSCs 组比较，MCAO+SS-MSC 组BDNF、NGF、HGF、VEGF 水平均升高（P＜0.05、P＜0.01）；与MCAO+NS-MSCs 组比较，MCAO+SS-MSC 组BDNF、HGF、VEGF 水平升高（P＜0.05、P＜0.01）。见图7。

图7 MCAO大鼠脑组织中BDNF、NGF、HGF、VEGF水平表达情况

2.8 免疫组化检测大鼠脑组织中BrdU、BDNF 与NGF的表达水平 与sham 组比较，MCAO 组大鼠脑组织中BDNF、NGF 表达水平下降（P＜0.05），BrdU 表达水平升高（P＜0.05）。与MCAO 组比较，MCAO+NS-MSCs 组与MCAO+SS-MSC 组Brdu、BDNF、NGF 表达水平均上升（P＜0.05 或P＜0.01）；MCAO+FBS-MSCs 组仅BrdU表达水平升高（P＜0.01）。与MCAO+FBS-MSCs 组比较，MCAO+SS-MSCs 组BDNF、BrdU、NGF 表达水平均上升（P＜0.05、P＜0.01）；MCAO+NS-MSC 组NGF 表达水平上升（P＜0.01）。与MCAO+NS-MSCs 组比较，MCAO+SSMSCs 组BrdU、BDNF、NGF 表达水平均上升（P＜0.05）。见图8。

图8 A. 脑组织中BrdU、BDNF与NGF水平表达情况（免疫组化染色×200，×400）；B. 脑组织BrdU、BDNF与NGF表达水平

3 讨论

MSCs 移植治疗缺血性脑卒中主要机制为细胞替代，血管生成及神经系统重建，并具有降低外周免疫抑制作用［2］。ASGARI 等［4］研究发现，脑卒中血清预处理MSCs 可通过CXCR4 和C-Met 信号迁移至梗死区，提高其治疗效果；MOON 等［5］研究表明，MSCs 经中风患者血清预处理可通过血管生成提高MSCs修复脑损伤的作用。

本研究造模的MCAO 大鼠神经功能缺损严重，与ZHAI 等［6］研究结果相符，而MSCs 移植干预可降低双侧贴纸去除时间、mNSS 评分，其中MCAO+SS-MSC 组改善效果明显，表明经脑卒中血清预处理MSCs 移植改善神经功能缺损效果最佳。可能是由于大鼠脑卒中血清中培养扩增MSCs 可维持骨髓细胞特征，因而更利于神经功能恢复［7］。

本研究结果显示，与sham 组比较，MCAO 大鼠脑梗死面积明显增加，脑组织及神经元病理性损伤加重，而MSCs 移植干预可有效减少脑梗死面积，改善脑组织损伤，且MCAO+SS-MSC 组改善明显。研究发现，VEGF、BDNF 表达水平升高对缺血性脑卒中有明显保护作用［8］。VEGF 参与调控内皮祖细胞，在血管生成、神经保护及建立侧支循环方面均有重要作用［9］。BDNF 可改善神经可塑性［10］，介导抗凋亡机制延缓神经细胞凋亡，诱导神经再生［11］。NGF 为神经细胞生长调节因子，在缺血缺氧状态下，可促进神经细胞增殖，修复受损神经，维持神经元正常生理功能。而HGF 为多效性生长因子，参与生长、再生及重塑等过程，其在梗死灶周围表达呈上升趋势。本研究中，MCAO+SS-MSC 组BDNF、NGF、HGF、VEGF 水平较MCAO 组升高（P＜0.01），且高于MCAO+FBS-MSCs 组、MCAO+NS-MSCs 组。免疫组化结果显示MCAO+SS-MSCs 组Brdu、BDNF、NGF表达水平较MCAO 组均上调，且高于MCAO+FBS-MSCs组、MCAO+NS-MSCs 组，表明脑卒中经血清预处理的MSCs 更能向脑组织梗死区迁移。

综上所述，经脑卒中血清预处理的MSCs 移植成功率高，且神经改善效果好，可能与脑卒中血清预处理能够增强MSCs 的活力和迁移能力，抑制脑组织细胞凋亡，上调BDNF、NGF、HGF、VEGF 水平有关。