叶伟 白文涛
汉坦病毒与机体干扰素免疫应答
叶伟 白文涛
汉坦病毒属(hantavirus，HV)是布尼亚病毒科的单负链RNA病毒，其基因组分为L、M、S 3个片段，分别编码病毒的RNA聚合酶(L)、包膜糖蛋白(Gn和Gc)和核衣壳蛋白(NP)，病毒主要分为引起肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)的旧大陆汉坦病毒和引起汉坦病毒心肺综合征(hantavirus cardiopulmonary syndrome，HCPS)的新大陆汉坦病毒。前者主要包括汉坦病毒原型株汉坦病毒(HTNV)、汉城病毒(SEOV)、多布拉伐病毒(DOBV)和普马拉病毒(PUUV)等，后者主要包括辛诺柏病毒(SNV)、纽约病毒(NY－1V)和安第斯山病毒(ANDV)等。除了这些病毒之外，还有被认为是不引起人类明显疾病的图拉病毒(TULV)和希望山病毒(PHV)等。
固有免疫是机体抵抗外来病原体入侵的第一道防线［1］。其中机体对病毒的识别是宿主产生免疫应答的先决条件病毒感染机体后，宿主通过一系列模式识别受体(pathogen recognition receptors，PRRs)来识别病毒的病原相关分子模式(pathogen－associated molecular patterns，PAMPs)从而引起干扰素(IFNs)等细胞因子的分泌，启动下游效应分子来抑制病毒的复制。目前业已阐明，PRRs主要包括Toll－样受体(Toll like receptor，TLRs)、视黄醛酸诱导基因I(RIG－I)样RNA解旋酶(retinoic acid－inducible gene I－like RNA helicases，RLHs)和棒状受体(NOD－like receptors，NLRs)等。同时，病原体在长期的进化过程中，也发展出了种类多样的逃避宿主固有免疫的手段和方法来达到感染复制的目的。本文拟就汉坦病毒与固有免疫的干扰素系统之间的关系做一简要综述。
一、固有免疫的干扰素系统
IFNs是自分泌或旁分泌的具有多种功能的蛋白质。主要分为3种类型:Ⅰ型干扰素(IFNα，IFNβ)、Ⅱ型(IFNγ)和Ⅲ型(IFNλ1，IFNλ2和IFNλ3)。其中Ⅰ型与Ⅲ型IFNs可在机体绝大多数组织与细胞中产生，而Ⅱ型IFN主要由包括巨噬细胞、树突状细胞(DC)和肥大细胞在内的多种免疫细胞产生［2，3］。IFN与细胞表面相应受体结合，激活Jak/Stat信号通路从而启动三聚的IFN刺激应答因子(ISRE3)与信号传递和转录激活分子1(Stat1)、Stat2和IFN应答因子9(IRF9)。随后ISRF3入核并结合位于大部分IFN诱导基因(ISGs)启动子区域上特异的IFN刺激反应元件(ISRE)，从而发挥其免疫效应［4，5］。
RNA病毒具有众多可被宿主PRRs所识别的PAMPs，TLR与RIG－I是目前已阐明的识别病毒PAMPs的受体。目前为止，包膜糖蛋白、dsRNA、5'端具有三磷酸的单链RNA、非甲基化的CpG DNA均被确定可与特异的PRRs反应［4］。PRRs参与识别后最终激活TNF受体相关因子3(TRAF3)、TRAF家族成员相关NF－κB激活蛋白结合激酶1(TBK1)和IκB－激酶ε(IKKε)等，并进而激活IRF3/IRF7［9］，最终引起下游干扰素基因的表达。
二、汉坦病毒与干扰素系统的相互作用
1．固有免疫识别汉坦病毒的机制:TRAF3已被证实参与了Ⅰ型和Ⅲ型干扰素的PRR信号通路［5］。A549细胞上TLR3正常表达水平比较低，IFN刺激后，A549并不能诱导抗病毒应答，而HTNV感染后的A549可以上调TLR3，使得TLR3下游抗病毒免疫应答成为可能［6］。TLR3主要表达在胞质的内体(endosome)中或细胞表面，通过其胞外区识别特异的PAMPs——dsRNA［7］。HTNV对TLR3的募集可导致抗病毒和炎症应答。HTNV的持续感染很可能是固有免疫应答的滞后和炎症反应的持续。此外，多种RNA病毒，例如流感病毒A、西尼罗河病毒、白蛉病毒等被发现可以通过TLR3来调节固有免疫的炎症应答，使炎症因子的表达增多。所以，TLR3的持续激活可能是炎症因子过量表达的诱因，这也可能病毒致病的一个因素。
利用不含有RIG－I基因的HuH 7．5细胞实验结果显示，PHV诱导早期固有免疫应答并不依赖RIG－I［6］。但最近Günther Schönrich的研究第一次发现体外转录HTNV N RNA和HTNV N ORF(开放读码框)诱导了RIG－I信号，表明RIG－I可以识别汉坦病毒的复制［8］。但HTNV RNA激活RIG－I的机制尚不清楚，该研究组的研究也与前期研究相似，即HTNV基因组RNA并不显着激活RIG－I［9］。而HTNV的cRNA是否是RIG－I的激活因子还需要进一步研究。
2．汉坦病毒对干扰素的诱导:体外汉坦病毒感染实验和中和试验已证实Ⅰ型干扰素(IFNα/β)是固有免疫应答的调节中心并可限制汉坦病毒的感染［10］。近期研究表明Ⅲ型干扰素和Ⅰ型干扰素参与了汉坦病毒在体内、体外诱导的固有抗病毒应答。PUUV感染的HFRS病人的急性期与恢复期血清相比，Ⅲ型干扰素水平有所降低。与PHV相比，在A549与HuH7细胞中，致病性的PUUV诱导了更低水平的IFNγ［11］。
致病性与非致病性汉坦病毒诱导固有免疫应答的机制在多种细胞系中是保守的。有的研究组报道在A549，HuH7中观察到了HTNV、PHV和ANDV感染产生的抗病毒与炎症应答，但也有研究报道称这些细胞系对SNV感染没有相关应答［11～13］。此外，敲除TRAF3与TLR3基因的A549细胞失去了对HTNV感染诱导黏病毒抗性蛋白A(MxA)的能力［6］。Vero E6细胞是Ⅰ型干扰素基因缺失的细胞系，早期观点是Vero E6对病毒感染并不能产生固有免疫应答。但最近有报道称，SNV、ANDV和PHV感染Vero E6后，可以检测到Ⅲ型干扰素的分泌［13］。此外，据Prescott及其同事报道称，由Vero E6扩增出的病毒储存液会含有不同量的IFNλ，这是一个新的发现，但这也说明了用Vero E6扩增出的病毒所得出的实验结论可能会有不同程度的偏差，或需要重新评价［13］。
mRNA表达水平分析显示，原代内皮细胞在PHV感染后诱导了高水平的MxA。但在NY－1V与HTNV感染中未发现MxA水平升高。作者推测可能是这些汉坦病毒抑制了早期IFN的应答。类似的研究结果也在TULV和HTNV间发现。内皮细胞并不具有IFNλ的功能性受体，所以来源于Vero E6细胞的病毒一般不会影响内皮细胞的ISGs的表达［13］。
多个研究组研究显示，重组Ⅰ型与Ⅱ型干扰素的预处理可有效抑制汉坦病毒的复制［14］。但感染若已经建立，则干扰素对病毒复制的干扰作用则显着降低［10，15］。而其中的一个原因是，宿主细胞产生的高水平的病毒编码的产物表达水平大大超过固有免疫系统效应分子所能处理的量。此外，重组的MxA预处理可以在Vero E6细胞中阻止汉坦病毒复制，但其机制尚不明了。其他病毒中，如正黏病毒科的Togoto病毒和与汉坦病毒同属布尼亚病毒科的La Crosse病毒的核蛋白可与MxA相互作用，且这种相互作用被认为是MxA通过消除病毒复制所需的NP来起作用，类似的相互作用可能也在汉坦病毒感染的细胞中存在［16］。为逃避MxA的效应，一些汉坦病毒可使MxA失去功能［11］。体内与体外的研究提示除MxA外，其他IFN诱导的抗病毒效应分子也可能参与了控制汉坦病毒感染的过程［17］。上述研究都显示，在病毒产物大量增多之前诱导出合适的固有免疫应答有利于控制病毒的感染。
3．汉坦病毒相关逃逸机制:为建立感染，病毒发展出了复杂和多重的策略来逃避或阻断宿主的抗病毒IFN系统。目前的研究显示ANDV、HTNV和PHV损害了与Ⅰ型干扰素激活的Stat1和Stat2。Stat1活化水平的降低并在胞质内的停滞也在外源表达ANDV的糖蛋白的细胞中观察到［15，18］。但ANDV与PHV都对IFN的下游通路具有类似的拮抗作用，故单独靶向激活Stat1/Stat2很难解释致病与非致病汉坦病毒固有免疫应答水平的不同的原因［18］。
核转录因子NF－κB，是IFN的增强子复合体的一个成分，并且是IFN高水平表达的必要成分［19］。最近有研究发现HTNV的核蛋白可以抑制TNF－α诱导的NF－κB的活化。外源表达核蛋白(NP)即可以阻断NF－κB p65亚基转运入核。与此对应，有报道称，NP与可控制蛋白穿越核孔的importin α蛋白有直接相互作用［20］。在SEOV、DOBV中也发现类似结果;而ANDV、SNV和PUUV中尚未见报道［21］。这些结果均表明了汉坦病毒发展出了多种规避固有免疫的策略。
PHV、PUUV和ANDV的基因组S片段还具有第2个开放读码框，可能编码一个非结构蛋白。目前已发现PUUV感染的Vero E6中有NSs－ORF的表达。且报告基因实验证实了PUUV的NSs－ORF可拮抗干扰素［22，23］。但NSs－ORF在致病性与非致病性汉坦病毒中都有发现，所以，NSs－ORF可能并不是汉坦病毒在人类中致病的决定因素。
Spiropoulou及其同事最早在1993年在美国四角区暴发的HCPS时分离出了HCPS的病原体。他们近期研究发现IRF3激活前，对ANDV和PHV感染的细胞有不同的影响［18］。与此相应，外源表达NY－1V的Gn胞质段尾部可以通过破坏TRAF3/TBK1复合体来阻断IRF3的激活。这与感染实验中发现TRAF3/TBK1的状态不稳定的结果类似。但表达PHV Gn胞质尾段或和PHV感染实验中均未发现TRAF3/TBK1复合体的分解［10，24］。
NY－1V Gn胞质尾段只有在蛋白酶抑制剂MG132存在时才可检测到，而MG132存在时也增加了ANDV和HTNV Gn胞质区的稳定性。与此相对，PHV的Gn胞质尾段在MG132存在与否时未见显着差别。此研究说明，致病性汉坦病毒的Gn可能是阻滞IFN应答的一个重要因素。但Gn胞质尾段可能并不是降低IFN应答的决定性因素。通过PHV和PUUV的体外基因重排，命名为PHPUV的病毒含有PUUV的M片段和PHV的S和L片段。这种表型的汉坦病毒与PUUV和PHV感染细胞实验相比，所表现的IFN系统的应答(包括MxA和IFN mRNA)都与PHV类似而与PUUV相反［11］。这说明这两种病毒对固有免疫应答的调节是由S与L片段决定的。早期研究表明非致病的PHV利用整合素β1而致病性PUUV利用β3作为受体而入胞的。这项实验说明了M片段编码的嚢膜糖蛋白在调节病毒特异的固有免疫应答上贡献甚微。这项研究的另一意义是，PHPUV感染可产生针对PUUV的中和抗体，而病毒本身又类似PHV对人不致病，所以有可能作为一种减毒活疫苗来使用。但其他类型的重组可能会造成新的疾病流行，有报道称Bunyamwera病毒与Batai病毒在体内的重组造成了严重的发热病的暴发。所以体内重排的危险因素也是应用重组病毒所要认真考虑的问题。
三、总结与展望
汉坦病毒在其自然宿主中是终身隐性感染，故各种病毒都有规避宿主免疫应答的成熟策略。目前已经确定RIG－I可识别汉坦病毒的复制信号，汉坦病毒可在被感染细胞中募集TLR3，多种汉坦病毒可以逃避MxA途径和抑制NF－κB启动下游信号，且多种汉坦病毒的Gn胞质尾段可以阻断IRF3的激活等等。鉴于固有免疫在机体抗病毒感染中的重要作用，明确汉坦病毒规避IFN系统的不同机制是确切阐明汉坦病毒致病机制的首先要解决的问题。
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(收稿:2011－11－15)
(修回:2011－11－18)
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国家自然科学基金资助项目(30972590，30970148)
710032西安，中国人民解放军第四军医大学微生物学教研室(叶伟);610083中国人民解放军成都军区总医院普通外科中心微创外科(白文涛)
白文涛，电子信箱:baiwtao@163．com
