董 琳 王志远 万春杰 陈兆兴 陈小芳
呼吸道合胞病毒(RSV)是婴幼儿下呼吸道感染(LRTI)一种最常见的病原，每年全球大约有60 万患儿因直接或间接感染RSV 而发生死亡［1］。生命早期的RSV 感染还与反复喘息、气道高反应性(AHR)及哮喘密切相关［2］。虽然这种相关性的内在本质尚未明确，但RSV 诱导的炎性介质释放和气道炎症持续存在可能发挥关键的作用［3］。RSV 能诱导多种趋化因子表达增加，包括单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP -1α)、白介素-8(IL -8)［4，5］。过度的趋化因子表达在RSV 感染的发病机制中起着重要作用，能够刺激和募集炎性细胞到感染部位，导致气道黏液分泌增多、上皮细胞损伤、脱落等炎性反应，出现气道阻塞和气道高反应性［6，7］。因此，阻断趋化因子的表达和释放，对治疗RSV 感染具有重要价值。活化过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)因具有显着的免疫调节、广泛的抗炎及抗病毒作用，其在RSV感染治疗中的作用令人关注［8，9］。
本研究采用人气道上皮细胞A549 细胞系建立RSV 感染的细胞模型，检测RSV 感染A549 细胞后不同时间MCP-1、MIP -1α 和IL -8 mRNA 表达和蛋白水平，并进一步观察15d-PGJ2和罗格列酮抑制剂干预的影响，以阐明RSV 感染时趋化因子的变化及PPARγ 激动剂的抑制作用及机制，为应用PPARγ 激动剂治疗RSV 感染提供理论依据。
材料与方法
1.材料和试剂:人Hep -2 和A549 细胞株购自中科院上海细胞生物研究所，来源于ATCC。RSV-Long 标准株购自中国预防医学科学院病毒所。15d -PGJ2(美国Biomol 公司)，罗格列酮(北京高盟化工有限公司)，PPARγ 拮抗剂GW9662(上海贝基生物科技有限公司)，PDTC(Sigma 公司)，RNA 引物(Invitrogen 公司)cDNA 第一链合成试剂盒(北京天根生化科技有限公司)，RealMasterMix(北京天根生化科技有限公司)，actin 抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG (碧云天生物技术研究所)，MCP-1、MIP-1α 及IL-8 ELISA 试剂盒(R＆D 公司)。
2.细胞培养:细胞接种于25cm2培养瓶中，用F12K 培养，置于5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱中，待细胞基本长满后，用0.25%胰蛋白酶进行消化传代;每隔2 ～3 天换液，待细胞长至80%融合状态时用于实验。
3.RSV 接种和增殖:将冻存的long 标准株复苏后接种于对数生长期单层Hep -2 细胞上，37℃、5% CO2培养箱吸附2h 后加入维持液，置温箱培养;逐日观察细胞病变效应(CPE)，待CPE 达75%以上(约2 ～5 天)，收获病毒悬液置-20℃≥2h、37℃反复冻融4 次。5000r/min 离心10min，弃沉淀，收集病毒上清液备用，-80℃保存。
4.RSV 半数感染量(TCID50)测定:Hep -2 细胞以1 ×105/ml 浓度接种于96 孔培养板，每孔100μl。病毒原液用维持液10 倍系列稀释9 个浓度即10-1，10-2，……，10-9。细胞长成单层时吸弃培养液，PBS 洗3 次，接种各稀释度的病毒液，每个浓度8 个复孔，每孔50μl。并设细胞对照组。置37℃、CO2培养箱中吸附2h，吸弃上清液，每孔加维持液100μl，置培养箱中继续培养。逐日观察CPE 并记录，连续观察7 天，用Reed-Muench 公式计算病毒的TCID50。
5. 实验分组:将传代培养的A549 细胞随机分为6 组:A组(15d-PGJ2+ RSV 组)、B 组(罗格列酮+ RSV 组)、C 组(RSV 对照组)、D 组(PDTC +RSV 组)、E 组(GW9662 +罗格列酮+ RSV 组)、F 组(细胞对照组)。A 组～E 组均以100TCID50 RSV 吸附2h 后加培养液培养。RSV 吸附前A、B、D 组分别给予15d-PGJ2(20μmol/L)、罗格列酮(20μmol/L)、PDTC(10μmol/L)预处理0.5h，F 组先以0.01% DMSO 预处理0.5h，再以不含RSV 的培养液培养。各组分别在培养12、24、48h 收获细胞及上清液待测。
6.实时定量RT -PCR 检测MCP -1、MIP -1α 及IL -8表达:收集培养的细胞，Trizol 法提取总RNA，按cDNA 第一链合成试剂盒获得cDNA 模板，置于-20℃保存备用。针对每一需要测量的基因和管家基因，选择一确定表达该基因的cDNA 模板进行PCR 反应。10mmol/L dNTP mix 1μl，10 × PCR Buffer 2.5μl，50mmol/L MgCl21.5μl，Taq DNA polymerase(5U/μl)0.4μl，扩增引物1(10μmol/L)1μl，扩增引物2(10μmol/L)1μl，cDNA 2μl，补38.1μl 灭菌蒸馏水至总体积为50μl。轻弹管底将溶液混合，设置PCR 反应:94℃变性2min;40 个PCR循环(94℃，20s;60℃，30s;72℃，30s)。MCP -1 上游引物:5' -TATTGTCCACTGACCCC - 3'，下游引物:5' - CTTCACCCAAGTCCTAAGGT - 3';MIP - 1α 上 游 引 物:5' -CTACGTCTCTTGACCAACGT - 3'，下游引物:5' - CACTCCTCACCCAGGTCTTT-3';IL -8 上游引物:5' -TAGCAAAATTGAGGCCAAGG -3'，下游引物:5' - AAACCAAGGCACAGTGGAAC-3';β -actin 上游引物:5' -TGCCCATTTATGAGGGCTAC - 3'，下 游 引 物:5' - GCCATCTCGTTCTCGAAGTC - 3'。PCR 产物与100bp DNA Ladder 在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR 产物是否为单一特异性扩增条带。PCR产物进行10 倍梯度稀释后的DNA 模板以及所有cDNA 样品分别配置real-time PCR 反应体系。体系参照RealMasterMix试剂盒，于real-time PCR 仪上进行PCR 反应。监测并收集荧光信号。扩增反应结束后建立PCR 产物的熔解曲线。2-△△Ct法计算各标本目的基因的相对表达量。
7.ELISA 检测MCP -1、MIP -1α 及IL -8 蛋白水平:无菌eppendorf 管收集A549 细胞培养上清液，置-80℃冰箱保存。应用ELISA 试剂盒严格按照说明书操作。
8.统计学方法:实验重复3 次，计量资料实验数据均以均数±标准差(±s)表示。采用SPSS 17.0 软件进行分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。多组样本均数比较采用单因素方差分析;两两比较方差齐者采用LSD 检验，方差不齐者采用Dunnett's-T3 检验。
结 果
1.RSV 感染及PDTC 干预后MCP -1、MIP -1α、IL-8 mRNA 和蛋白表达的变化:如图1 及表1 ～表3所示，C 组与F 组相比，MCP-1、MIP-1α、IL-8 mRNA 和蛋白的表达均在12h 开始升高，其中mRNA 表达在24h 达高峰，48h 有所下降，与12h 的表达相近，差异无统计学意义(P 均＞0.05);而蛋白的表达在48h 达高峰，与12h 比较差异有统计学意义(P 均＜0.05);D 组各时间点3 种趋化因子mRNA 和蛋白的表达均明显低于C 组(P 均＜0.05)，但仍高于F 组(P 均＜0.05)。
表1 PPARγ 激动剂干预对RSV 感染MCP-1 mRNA 及蛋白表达的影响(±s，n=4，pg/ml)
与C 组比较，* P ＜0.05;与F 组比较，#P ＜0.05
组别12h 24h 48h mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白A 组 1859.20 ±36.403* 250.860 ±13.105* 1959.957 ±45.609* 256.193 ±11.670* 1718.690 ±31.309* 269.845 ±11.646*B 组 1881.913 ±69.045* 261.333 ±10.832* 1957.190 ±51.828* 267.232 ±10.625* 1739.836 ±31.319* 277.152 ±10.826*C 组 2427.218 ±59.697# 299.061 ±10.656# 2862.060 ±51.526# 308.134 ±11.321# 2386.833 ±42.969# 367.606 ±11.142#D 组 1869.304 ±33.452* # 262.500 ±10.942* # 2031.330 ±28.600* # 264.515 ±10.813* # 1737.157 ±22.894* # 274.035 ±10.747* #E 组 2305.675 ±63.749# 288.852 ±11.683# 2691.560 ±56.187# 295.366 ±10.382# 2241.673 ±43.550# 339.449 ±13.123#F 组 1035.543 ±22.609* 151.305 ±11.157* 1007.398 ±21.047* 170.697 ±10.181* 1124.348 ±16.476* 149.868 ±13.157*
表2 PPARγ 激动剂干预对RSV 感染MIP-1α mRNA 及蛋白表达的影响(±s，n=4，pg/ml)
表2 PPARγ 激动剂干预对RSV 感染MIP-1α mRNA 及蛋白表达的影响(±s，n=4，pg/ml)
与C 组比较，* P ＜0.05;与F 组比较，#P ＜0.05
组别12h 24h 48h mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白A 组 361.117 ±21.036* 333.570 ±11.015* 378.687 ±25.725* 340.954 ±10.850* 343.072 ±18.471* 364.918 ±10.644*B 组 381.583 ±22.436* 379.530 ±10.881* 385.367 ±13.059* 370.202 ±10.577* 367.411 ±17.909* 385.513 ±11.725*C 组 469.296 ±30.146# 410.173 ±11.052# 569.500 ±26.803# 398.223 ±11.624# 471.853 ±30.448# 512.631 ±11.361#D 组 394.196 ±14.146* # 369.595 ±10.770* # 430.910 ±11.651* # 357.454 ±11.045* # 373.933 ±15.041* # 371.655 ±10.710* #E 组 423.410 ±9.070# 395.889 ±11.800# 522.780 ±14.545# 387.303 ±11.082# 433.972 ±26.809# 474.418 ±11.415#F 组 295.679 ±13.679* 90.516 ±8.070* 305.398 ±14.893* 92.013 ±5.400* 323.348 ±16.981* 84.214 ±11.650*
表3 PPARγ 激动剂干预对RSV 感染IL-8 mRNA 及蛋白表达的影响(±s，n=4，pg/ml)
表3 PPARγ 激动剂干预对RSV 感染IL-8 mRNA 及蛋白表达的影响(±s，n=4，pg/ml)
与C 组比较，* P ＜0.05;与F 组比较，#P ＜0.05
组别12h 24h 48h mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白A 组 0.411 ±0.001* 2140.106 ±49.12* 0.568 ±0.004* 2219.52 ±85.147* 0.488 ±0.101* 2660.055 ±40.081*B 组 0.460 ±0.001* 2211.201 ±38.328* 0.651 ±0.001* 2313.66 ±67.866* 0.567 ±0.221* 2741.675 ±81.168*C 组 2.420 ±0.016# 3480.152 ±52.218# 2.929 ±0.020# 3528.256 ±88.755# 2.594 ±0.013# 3713.152 ±30.297#D 组 1.926 ±0.013* # 2693.176 ±76.213* # 2.633 ±0.018* # 2914.75 ±99.529* # 2.045 ±0.018* # 3353.182 ±61.493* #E 组 2.280 ±0.014# 3001.620 ±65.341# 2.823 ±0.015# 3111.62 ±59.245# 2.269 ±0.020# 3438.342 ±66.648#F 组 0.635 ±0.201* 2191.746 ±49.17* 0.625 ±0.021* 2218.897 ±41.774* 0.601 ±0.001* 2281.756 ±56.971*
2. PPARγ 激动剂及GW9662 干预对RSV 感染MCP-1、MIP-1α、IL-8 mRNA 和蛋白表达的影响:如表1 ～表3 所示，A 组、B 组与C 组相比，各时间点MCP-1、MIP -1α、IL -8 mRNA 和蛋白的表达均明显降低(P 均＜0.05);E 组与C 组相比，各时间点3种趋化因子蛋白及mRNA 的表达差异无统计学意义(P 均＞0.05)，但仍高于F 组(P 均＜0.05)。
讨 论
气道上皮细胞是RSV 感染的靶细胞，RSV 在其中复制能分泌大量的IL-8、MCP-1、MIP-1α 等趋化因子，其中IL-8 属于CXC 家族成员，对中性粒细胞有强烈的趋化和激活作用;MIP-1α 和MCP-1 属于CC 趋化因子，可募集中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞到炎症部位。纯化的RSV G 蛋白可以刺激人支气管上皮细胞IL -8 和MCP -1 的分泌，F 蛋白则促使这些产物向炎症部位趋化渗出［10］。Seki 等［4］的体外研究发现，胎儿肺纤维母细胞RSV 感染24h 后，包括IL-8、MCP-1 和MIP-1 在内的多种炎性介质表达升高，提示趋化因子和细胞因子的过度产生可能与RSV 诱导的过度变态反应性炎症的病生机制有关。体内研究显示，RSV 感染后肺部炎性反应的程度及病情与鼻咽分泌物、BALF 或肺组织中IL -8、MIP-1α 和MCP-1 水平相关，表明这些趋化因子在RSV 感染的气道炎症中发挥了重要作用，还可以用来评估病情及指导治疗［11～13］。本实验结果显示:RSV 感染后A549 细胞MCP -1、MIP -1α 和IL - 8 mRNA 和蛋白的表达明显升高，其中基因的表达自感染后12h 开始明显增加，高峰时间在24h;蛋白的表达则自感染后12h 明显增加，高峰时间在48h，与文献报道相一致［10，13］。证实RSV 感染可诱导MCP -1、MIP-1α 和IL- 8 的表达和释放。
核转录因子-κB(NF-κB)是调控趋化因子、细胞因子等炎性介质基因转录的关键转录因子，激活后可引发全面的炎性反应。PDTC 是是NF-κB 特异性阻断剂，可抑制NF -κB 的p65 亚单位，并具有金属螯合作用，通过抑制NF -κB 信号通路，抑制炎性因子基因的表达从而减少其释放［14］。本研究预先应用PDTC 处理RSV 感染的A549 细胞，结果能明显下调MCP-1、MIP-1α 和IL -8mRNA 表达和蛋白分泌，证明NF-κB 的激活在调节趋化因子的表达中有重要作用。抑制NF-κB 信号通路活化，阻断趋化因子的表达和释放，可为抑制RSV 诱发的气道炎症、减轻病情提供可靠的治疗手段［6，12］。
抑制NF-κB 信号通路激活，下调细胞因子和趋化因子表达，减少炎性细胞募集是PPARγ 激动剂主要抗炎机制［15］。PPARγ 激动剂可直接与NF - κB p65/p50 结合，降低NF -κB 与DNA 的结合活性，也可通过抑制NF - κB 复合物抑制因子(IκB)激酶(IKKs)活性，减少IκB-α 降解而下调趋化因子。体内外研究显示15d -PGJ2能抑制IL -8 mRNA 及蛋白水平，延缓IκB-α 降解;而吡格列酮能抑制NF -κB 活性及MCP -1 表达［16］。Arnold 等［17］的研究结果显示，15d-PGJ2和罗格列酮干预对RSV 增殖有显着的抑制作用，并能有效减少RSV 诱导的细胞因子及合胞体形成，显着抑制RSV 表面黏附蛋白G 和融合蛋白F 蛋白表达，表明其对RSV 感染兼有抗病毒和抗炎作用。本实验通过研究15d -PGJ2和罗格列酮对RSV 感染A549 细胞的趋化因子表达水平来探讨PPARγ 激动剂的体外抗炎作用，结果发现15d -PGJ2和罗格列酮干预均可下调RSV 感染的MCP -1、MIP-1α 和IL-8 蛋白和mRNA 和表达，而预先应用PPARγ 拮抗剂GW9662 后可以阻断罗格列酮的上述作用，表明15d-PGJ2和罗格列酮有体外抑制RSV感染MCP-1、MIP-1α 和IL-8 表达的作用，也进一步证实了趋化因子在RSV 诱导的气道炎症中的作用。
综上所述，本研究为PPARγ 激动剂治疗RSV 感染的作用及其机制提供了理论证据，由于PPARγ 激动剂具有多方面的抗炎作用和抗氧化作用，其在RSV感染中是否还可通过非PPAR 依赖的途经发挥作用尚未明确，有待于今后进一步研究。
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