王 蕾 苏华斌 卢 琼

糖尿病及其慢性并发症的形成与糖尿病患者体内高血糖引起氧化产物增加，处于氧化应激状态密切相关，氧化应激状态导致血管内皮细胞异常凋亡，易于诱发血栓形成，导致循环障碍，其是心血管疾病的始动因素。机体有多种酶参与活性氧的生成，如NADPH 氧化酶、黄嘌呤氧化酶、线粒体呼吸链酶复合体、内皮型一氧化氮合酶及脂氧合酶等［1～4］。为探讨内皮细胞氧化损伤途径，本研究以人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)为研究对象，用高糖处理HUVECs，观察ROS 生成和内皮细胞凋亡情况，同时分别用NADPH 氧化酶、黄嘌呤氧化酶、线粒体电子传递链及环氧合酶的特异抑制剂氯化二亚苯苯基碘嗡(DPI)、别嘌呤醇(oxypurinol)、鱼藤酮(rotenone)、吲哚美辛预处理人脐静脉内皮细胞再加入高浓度葡萄糖，分析ROS 的水平，初步确定高糖刺激下ROS 产生主要来源，本实验结果表明NADPH 氧化酶为高糖刺激下活性氧产生的主要来源，因此本实验进一步检测高糖刺激下内皮细胞NADPH 氧化酶亚单位gp91phox(NOX2 和NOX4)和p22phox、p47phox、p67phox 及rac 蛋白表达变化。

资料与方法

1.实验分组:①正常对照组:正常血清培养;②高糖处理组:20mmol/L 葡萄糖处理4h 组(预实验后选择浓度);③DPI处理组:DPI 5μmol 预处理0.5h 再加入20mmol/L 葡萄糖处理4h 组;④别嘌呤醇处理组:3μmol 别嘌呤醇预处理0.5h 再加入20mmol/L 葡萄糖处理4 小时组;⑤鱼藤酮处理组:1μmol鱼藤酮预处理0.5h 再加入20mmol/L 葡萄糖处理4h 组;⑥吲哚美辛处理组:5mg 吲哚美辛预处理0.5h 再加入20mmol/L葡萄糖处理4h 组。

2.方法:(1)原代人脐静脉内皮细胞分离:取长约20cm的无菌新鲜脐带，以生理盐水冲洗脐静脉3 次，0.1%的Ⅱ型胶原酶(Promega 公司)灌注脐静脉15min，收集灌注液，800r/min 离心6min，收集内皮细胞，20%胎牛血清(HYCLONE 公司)的M199 混合培养基(GIBCO 公司)培养。(2)细胞内ROS 的检测:用2，7 -二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH -DA)荧光染色检测细胞内ROS，严格按照碧云天公司试剂盒说明书操作。(3)Hochest 染色:①胰酶消化、离心收集内皮细胞;②加PBS 洗1 遍;③Hochest 染液染色10min;④加入PBS 洗两遍:⑤取50μl 滴于玻片上;⑥倒置显微镜观察。(4)PI 染色:①收集细胞，离心5min，弃去培养液;②PBS 洗涤1 次;③离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定;④离心弃去固定液，PBS 重悬5min;⑤用PI 染液染色，4℃避光30min;⑥流式细胞仪检测。(5)Western blot 法检测:细胞裂解蛋白经SDS -PAGE 电泳后转移到PVDF 膜上，封闭过夜后，与相应一抗(Santa Cruz 产品)孵育后，再与辣根过氧化物酶标记的二抗(Promega 产品)孵育，洗膜后，应用ECL 试剂盒进行化学发光反应，最后曝光后显影，定影。

结 果

1.DPI、别嘌呤醇、鱼藤酮和吲哚美辛对内皮细胞活性氧生成的影响:与对照组相比，高糖组内皮细胞活性氧的生成明显增高，别嘌呤醇处理组、鱼藤酮处理组和吲哚美辛处理组活性氧生成也都较对照组明显升高，而DPI 处理组内皮细胞活性氧的生成与对照组差异无统计学意义;与高糖组相比，DPI 处理组内皮细胞活性氧的生成明显减少，而别嘌呤醇处理组、鱼藤酮处理组和吲哚美辛处理组与高糖组相比，差异无统计学意义(图1)。

图1 流式细胞仪检测高糖和4 种特异性抑制剂对HUVECs 活性氧生成的影响

2.Western blot 法检测高糖对细胞内NADPH 氧化酶亚单位的蛋白表达水平:DPI 为NADPH 氧化酶特异抑制剂，因此本实验进一步检测高糖刺激下内皮细胞NADPH 氧化酶亚单位NOX2、NOX4、p22phox、p47phox、p67phox 及rac 蛋白表达变化。与对照组相比，高糖处理组HUVECs 中细胞NOX4 蛋白表达显着增 高(P ＜0. 05，n = 3)，而NOX2、p47phox、p67phox、p22phox 和Rac 表达差异无统计学意义(图2)。

图2 Western blot 法检测高糖对HUVECs NADPH 氧化酶亚单位的蛋白表达调节

3.高糖对内皮细胞凋亡的调节:流式细胞仪和Hochest 染色结果显示，与对照组相比，高糖处理组HUVECs 中细胞凋亡比例显着增高(P ＜0.05，n =3，图3)。

讨 论

图3 流式细胞仪与Hochest 检测高糖对HUVECs 凋亡的调节

在我国，糖尿病是导致成人失明和非创伤性截肢的主要原因，其慢性并发症可累及全身各个重要器官。糖尿病及其慢性并发症的形成与糖尿病患者体内高血糖引起氧化产物增多密切相关，活性氧增多导致血管内皮细胞过度凋亡，易于诱发血栓形成，这是心血管疾病的始动因素［5］。高血糖导致血管损伤与多元醇途径激活、晚期糖基化终末产物形成增加、蛋白激酶C 途径激活及己糖胺通路激活等有关，其中高血糖时线粒体电子传递链过氧化物产生过量引起氧化应激，是以上各条途径的共同机制［6～9］。

本实验研究表明，高糖可诱导内皮细胞活性氧生成增多，并且伴随细胞凋亡的增高。初步证明高糖诱导细胞损伤的原因与氧化应激有关。因此对糖尿病患者氧化应激机制的研究对寻找有效降低糖尿病慢性并发症的干预措施具有重要的意义。因此本研究进一步检测不同活性氧产生途径对高糖诱导的活性氧生成的影响，发现NADPH 氧化酶特异性抑制剂DPI 能够显着抑制高糖诱导的ROS 生成，由此笔者推测高糖可能通过激活NADPH 氧化酶使ROS 生成增多。NADPH 氧化酶包含胞膜成分即细胞色素b558(gp91phox 和p22phox)和胞质成分(p47phox、p67phox 及小的GTP 结合蛋白rac)。现已发现的gp91phox 同工酶家族即NOX(NADPH oxidase)家族有NOX1、NOX2(gp91phox)、NOX3、NOX4、NOX5 等成员，内皮细胞主要表达NOX4 和NOX2［8，10］。实验进一步用Western blot 法检测NADPH 氧化酶亚单位的表达，结果发现，高糖使NADPH 氧化酶亚单位NOX4 蛋白表达增高，由此推测NOX4 在高糖诱导的氧化应激损伤中发挥主要作用。

综上所述，NADPH 氧化酶可能为高糖刺激下内皮细胞活性氧产生的主要来源，这为预防糖尿病慢性并发症提供新的思路。

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