RNAi沉默Galectin-1基因对HePG2肝癌细胞增殖、凋亡的影响

张晖汉 张有成 王哲元

Galectin-1在许多肿瘤中的表达水平上调，如星形细胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌、膀胱癌、甲状腺癌、结肠癌、卵巢癌等，并与其侵袭能力及恶性程度密切相关[1，2]。因此，笔者推测，Galectin-1在原发性肝癌的发生和侵袭转移的过程同样起重要作用。本研究用siRNA技术沉默人肝癌细胞系HePG2细胞株中Galectin-1基因的表达，从而观察Galectin-1在肝细胞癌发生、发展中的作用。

材料与方法

1.主要材料与试剂:人肝癌细胞系HePG2细胞株购自四川医学中心，BLOCK-iTTMAlexa Fluor Red Fluorescent Oligo，Lipofectamine RNAiMax，Opti-MEM Reduced Serum Medium购自美国Invitrogen公司，Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit购自立陶宛(MBI)Fermentas公司，PCR荧光定量试剂盒购自上海生工生物制品有限公司，Millicell小室购自美国Millipore公司。

2.siRNA的设计与合成：针对人Galectin-1 mRNA 的Stealth RNA由美国Invitrogen Inc设计并合成(编号为HSS106024、HSS106025、HSS106026)，并采用与Stealth RNA GC含量相当的中GC含量的阴性对照以排除脂质体转染对细胞的影响。3条短双链siRNA核苷酸序列分别为：HSS106024：正义链5′-UUGCUGUUGCACACGAUGGUGUUGG-3′，反义链5′-CCAACACCAUCGUGUGCAACAGCAA-3′，HSS106025：正义链5′-UGAUGCACACCUCUGCAACACUUCC-3′，反义链5′-GGAAGUGUUGCAGAGGUGUGCAUCA-3′，HSS106026：正义链5′-CACUCUCCAGGUUUGAGAUUCAGGU-3′，反义链5′-ACCUGAAUCUCAAACCUGGAGAGUG-3′。上述核苷酸序列在BLAST中进行对比确定只有Galectin-1 mRNA是其靶点。

3.细胞培养与转染效率的确定：人肝癌细胞系HePG2在37℃，5%CO2恒温细胞培养箱中培养，采用含10%标准胎牛血清，100μ/ml链霉素和青霉素的高糖DMEM培养基，细胞融合度达到70%左右的对数生长期细胞用于本实验。本实验采用脂质体lipofectamine RNAiMax转染试剂盒将合成的Steslth RNA转染至人肝癌细胞系HePG2，同时阴性对照用来避免非特异性寡核苷酸导入细胞内对细胞的影响。BLOCK-iTTMAlexa Fluor Red Fluorescent Oligo用来优化最佳siRNA与lipofectamine RNAiMax浓度比例及单细胞悬液浓度。将Lipofectamine RNAiMax与BLOCK-iTTMAlexa Fluor Red Fluorescent Oligo以不同浓度比例在细胞培养板内混匀，室温下孵育30min，加入用10%标准胎牛血清无抗生素高糖DMEM培养基稀释HePG2单细胞悬液，37℃，5%CO2恒温细胞培养箱中培养24h后观察转染效率。每孔加入的细胞数在培养24h后细胞融合度达到30%～50%为宜。

4.RT-PCR检测干扰效率：在6孔细胞培养板中用反向转染的方法转染人HePG2细胞2.5×105/ml，48h和72h后用UNlQ-10 柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA，取样进行琼脂糖凝胶电泳，紫外观测灯下观察28S、18S、5S 3个条带，以确定提取的RNA的完整性。第一链cDNA反转录采用Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit，合成的cDNA在Roter Gene 6000荧光定量PCR仪上进行扩增，并分析结果。本实验采用20μl反应体系，其中包括Premix 10μl，上下游引物各0.6μl，cDNA 2μl，DEPC水 6.8μl。β-actin作为内参照。PCR引物由上海生工合成，Galectin-1上游引物：5′- AACCTGGGCAAAGACAGCAACA-3′，下游引物：5′- GCGGTTGGGGAACTTGAATTCGTA -3′，β-actin上游引物：5′- GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA -3′，下游引物：5′- GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG -3′。最终扩增条件为：95℃变性15min，95℃ 15s，57℃ 30s，72℃ 45s，共40次循环，然后进行溶解曲线分析，以确定无非特异性扩增。每组样品△Ct值计算方法为ΔCt = CtGalectin-1-Ctβ-actin， ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt空白对照组。最终实验组相对于空白对照组Galectin-1 mRNA表达水平为 2-ΔΔCt。

5.流式细胞仪检测凋亡：在50ml标准细胞培养瓶中转染人HepG2细胞，48h后1000r/min离心5min收集上清液中悬浮细胞，预冷PBS冲洗两次以除去残留血清，0.25%胰酶消化贴壁细胞成单细胞悬液，计数105个细胞，1000r/min离心5min，保留0.5ml液体，加入预冷75%乙醇以固定细胞，4℃过夜，进行染色检测。

6.MTT法检测细胞增殖率：在96孔细胞培养板中反向转染Stealth RNA及阴性对照48h，每孔加入5mg/ml MTT 20μl，37℃，5%CO2细胞培养箱中孵育4h，弃去上清液，加入DMSO 150μl，充分振荡至结晶完全溶解，在酶标仪490nm波长处测吸光度值A490nm。每组平行设4个复孔，实验重复3次。细胞增殖率计算方法为：实验组细胞增殖率=实验组平均A490nm/空白对照组平均A490nm×100%。

7.Millicell小室细胞迁移模型检测肿瘤细胞迁移能力：Millicell小室上室加入300μl Opti-MEM无血清培养基室温静置30min，弃去上清以水化基质胶。在50ml标准细胞培养瓶中反向转染人HePG2细胞48h后，0.25%胰酶消化离心收集细胞，PBS清洗两次以除去血清的影响，Opti-MEM无血清培养基重悬细胞，调整浓度为5×105/ml。Millicell小室上室加入400μl单细胞悬液，24孔板下室内加入含15%新生牛血清高糖DMEM培养基500μl，37℃，5%CO2细胞培养箱中常规培养12h。棉签擦去上室细胞，3%戊二醛固定，Giemsa染色，200倍倒置显微镜下计数中间及周边5个视野穿透细胞数。每组平行设置3个复孔。迁移率=实验组平均每视野透膜细胞数/空白对照组平均每视野透膜细胞数×100%。

结 果

1.转染效率及优化条件：本项实验采用BLOCK-iTTMAlexa Fluor Red Fluorescent Oligo用来优化最佳SiRNA与Lipofectamine RNAiMax浓度比例及单细胞悬液浓度。HepG2细胞在反向转染24h后在荧光显微镜下计数红色荧光信号的细胞并计算转染效率。实验表明，当Oligo终浓度为30nmol/L，单细胞悬液浓度为105/ml时，转染效率可达到90%以上。因此，以后的实验采用30nmol/L的siRNA和105/ml HePG2单细胞悬液为转染条件，鸡尾酒组(cocktail group)3条siRNA终浓度均为15nmol/L[3](图1)。

图1 HePG2红色荧光标记寡核苷酸转染效果图A.普通光镜视野下所见(×200);B.荧光显微镜同一视野下(×200)所见，可见90%以上细胞成功转染，且细胞形态未见明显改变

2.siRNA显着下调Galectin-1基因在人HePG2细胞中的表达水平：采用实时定量RT-PCR检测Stealth RNAi后人肝癌细胞系HePG2中Galectin-1 mRNA表达水平的变化。在β-actin mRNA表达水平相对稳定的条件下，RNA干扰后人HePG2细胞中Galectin-1 mRNA表达水平明显下调。在3条不同序列Stealth RNA中，HSS106024对人HePG2细胞中Galectin-1 mRNA表达抑制作用明显强于HSS106025、HSS106026，相比之下，鸡尾酒组表现出最强抑制效果，同时阴性对照组未见明显对Galectin-1 mRNA表达的抑制作用。数据分析显示，HSS106024 转染48h及72h后人HePG2细胞Galectin-1 mRNA表达水平分别为空白对照组的16.3%、12.8%，鸡尾酒组转染48h及72h后Galectin-1 mRNA表达水平分别为空白对照组的12.9%、10.3%，HSS106025及HSS106026转染48h及72h后Galectin-1 mRNA表达水平分别为空白对照组的29.5%、21.6%和30.4%、37.4%。空白对照组与RNA干扰各组之间Galectin-1 mRNA表达水平差异有统计学意义(P<0.01)。干扰48h及72h对HepG2细胞Galectin-1 mRNA表达水平的抑制作用差异无统计学意义，因此后续实验组采用干扰48h及鸡尾酒组和HSS106024组为实验条件(图2)。

图2 RNA干扰后各组Galectin-1 mRNA表达水平比较

3.siRNA抑制Galectin-1表达明显诱导人肝癌细胞系HePG2凋亡：流式细胞仪分析结果显示，采用RNA干扰技术抑制Galectin-1的表达可以明显促进人肝癌细胞系HePG2的凋亡。其中鸡尾酒组表现出最强的诱导HePG2细胞凋亡作用，细胞凋亡率达到31.4%，编号HSS106024 siRNA干扰组细胞凋亡率为22.5%，阴性对照组细胞凋亡率为1.6%，空白对照组未见明显细胞凋亡(图3)。

4.RNAi抑制Galectin-1表达可抑制人肝癌细胞系HePG2增殖：MTT法结果显示，实验组490nm波长处吸光度值A490nm明显小于空白对照组和阴性对照组(P<0.01)，空白对照组和阴性对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，HSS106024和鸡尾酒组细胞增殖率分别为54.6%和54.0%(表1)。

5.RNAi抑制Galectin-1表达降低人肝癌细胞系HePG2迁移能力：Millicelll小室细胞迁移模型结果显示，RNAi抑制Galectin-1在人肝癌细胞系HePG2中的表达可以明显抑制肿瘤细胞的迁移能力，空白对照组及阴性对照组平均每高倍视野下透膜细胞数124.27±12.05，117.80±10.60明显高于HSS106024和鸡尾酒组65.00±5.53，63.33±5.72，实验组与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，阴性对照组与空白对照组比较，差异无统计学意义(表2)。

讨 论

随着对半乳糖凝集素家族成员研究的广泛展开，其生物学活性，尤其在肿瘤发生、发展过程中的重要作用日益受到研究人员的重视[4]。Galctin-1作为半乳糖凝集素家族中的成员之一，广泛存在于多种肿瘤组织和细胞中，并呈高表达状态，通过细胞内信号传导途径参于肿瘤细胞发生、发展的各个过程，如肿瘤细胞的黏附、增殖、迁移、侵袭、凋亡等过程[2，5～9]。

图3 RNA干扰48h后各组细胞凋亡率各组细胞转染48h后，经PI(碘化丙啶)染色后流式细胞仪法检测细胞凋亡，试剂盒采用Annexin V加PI的双重染试剂盒

表1 RNA干扰48h后HePG2细胞增殖能力的比较

表2 RNA干扰48h后对HePG2细胞迁移能力的影响

两独立样本t检验，与空白对照组比较，P<0.05

已有研究表明，Galectin-1在肝癌原发灶组织中表达水平明显增高[10]。然而，Galectin-1在肝癌细胞中表达水平升高是否与肝癌的生物学行为有关尚不清楚。笔者推测Galectin-1可能参与了肝细胞癌的凋亡或侵袭过程。本研究设计了针对Galectin-1基因的siRNA，并将后者用于肝细胞癌HePG2的Galectin-1的沉默，结果表明，用siRNA转染并沉默Galectin-1基因的表达(89.7%)是完全可行的。说明通过RNA干扰技术可以探索Galectin-1在肝癌发生、发展中所发挥的作用。

根据本研究结果，人肝癌细胞系HePG2在转染了针对Galectin-1 mRNA 的短双链siRNA后，其细胞内Galectin-1 mRNA表达明显受到抑制，且HePG2细胞的凋亡明显增加。Galectin-1能够激活Ras，是Ras信号途径的一个调节因子，而Ras的激活可以导致细胞增殖、衰老和死亡等不同的生物学效应。另外，关于肝细胞性肝癌细胞系(HePG2)的体外研究证实，Galectin-1有助于促进肝细胞性肝癌中上皮间质转化的过程，TCF4/LEF1转录因子的调节被认为可能与这一作用有关[11]。因此，Galectin-1对肿瘤细胞的凋亡可能存在双向调节作用，其机制有待于进一步研究。

笔者还观察到，RNA干扰技术抑制人肝癌细胞系HePG2细胞中Galectin-1 mRNA表达后，其增殖和迁移能力同时受到抑制。在宫颈癌中，Kim等研究发现，应用反义mRNA或siRNA抑制Galectin-1的活性可显着抑制肿瘤细胞的增殖。Toussaint等[12]关于Galectin-1的体外实验表明，它可以增强胶质母细胞瘤的迁移和侵袭能力，而患者Galectin-1高表达者也更易浸润、预后更差。因此，推测内源性Galectin-1可能具有促进细胞增殖活性的作用。研究表明，在脑神经胶质瘤肿瘤微环境中，Galectin-1可以促进髓系来源抑制细胞的蓄积以及促血管生成环境的形成[13]。研究还表明，Galectin-1可能参与肿瘤转移的细胞黏附、聚集、新生血管形成等多个过程。半乳糖凝集素家族可以和细胞膜表面参与信号识别的半乳糖苷结合，它们可能通过此途径调节相邻肿瘤细胞间或肿瘤细胞与细胞外基质间的黏附能力；Galectin-1可以增加前列腺癌和卵巢癌细胞系与细胞外基质间的黏附能力[14，15]。Jouve等[16]研究表明，Galectin-1可以介导胃癌内皮细胞凋亡的调节。Laderach等[15]的体外实验证明Galectin-1在与肿瘤相关的微血管中上调，并且可以调节肿瘤与与血管内皮细胞间的相互作用。另外，有研究表明，抗血管内皮生长因子可以用于治疗肿瘤，主要是是通过促进肿瘤细胞分泌Galectin-1，炎性因子及低氧环境可促进这一过程的发生。因此可以认为，Galectin-1可能是参与肿瘤新生血管形成的一个重要因素。

综上所述，利用RNA干扰技术抑制人肝癌细胞系HePG2Galectin-1 基因的表达，可以显着促进肿瘤细胞发生凋亡，同时抑制肿瘤细胞的增殖和迁移能力。鉴于Galectin-1在多种肿瘤组织或细胞中高表达，并且在肿瘤生长和转移过程中起重要作用，使其可能成为多种肿瘤分子靶向治疗的一个新靶点。