梁淑慧 黄燕晓 李 翠 孙六娜 邓日辉 黄 惠 周迎春

CD4+T细胞是机体免疫系统发挥免疫应答功能的主要效应细胞之一, 滤泡辅助性T细胞(T follicular helper cells，Tfh)是CD4+T细胞近年发现的又一新亚群，主要对B细胞诱发体液免疫和长寿命浆细胞的形成提供帮助。Tfh细胞定位于淋巴滤泡生发中心，可持续的表达趋化因子受体5(CXCR5)和高水平的诱导性协同刺激分子(ICOS)及程序性死亡分子-1(PD-1)，产生效应因子IL-21、B-淋巴细胞趋化因子(CXCL13)是其分化发育的关键转录因子[1]。人转化生长因子β2(TGF-β2)能协助IL-21促进初始B细胞增殖和分化。已经有研究发现，Tfh细胞及其相关表达分子在RA和SLE等自身免疫性疾病的发生、发展中有重要关系[2～4]。慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)除有肝脏免疫病理损伤外，还存在由自身免疫反应引起的免疫损伤，其共同导致包括肝和肝外组织在内的机体免疫损伤，且与乙肝的临床类型、进程、病程相关，但具体的自身免疫应答机制未明[5]。本研究主要探讨CHB患者外周血中Tfh细胞相关表达分子CXCR5、CXCL13、IL-21和TGF-β2的表达水平，并观察CHB患者自身抗体出现的频率，分析其关联性。

对象与方法

1.研究对象：(1)选取2018年10月～2019年3月于笔者医院就诊的门诊或病房CHB患者共50例，其中男性29例，女性21例，患者年龄20～65岁，平均年龄为37.74±11.63岁，诊断符合《慢性乙型肝炎诊断标准(2015年版)》，同时排除合并甲、丙、丁、戊型等病毒性感染，以及药物性肝炎、酒精性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝病等其他肝炎。(2)选取来笔者医院体检中心做体检的健康人群共30例，其中男性17例，女性13例，年龄20～60岁，平均年龄为35.80±12.42岁，既往体健，无肝脏、肾脏、胃、肠道疾病史，经实验室检测排除HBV感染和ALT、AST异常。

2.方法：(1)所有入组对象均知情同意后留取空腹血4ml，离心分离血清，置于-70℃冷冻保存待用。(2)采用ELISA定量检测试剂盒(上海一基实业有限公司)分别测定CHB患者组和对照组CXCR5、CXCL13、IL-21和TGF-β2，严格按操作说明进行，在ELX808酶标仪(美国Bio-Rad公司)上比色，计算定量结果。(3)采用间接免疫荧光法检测试剂盒[欧蒙医学诊断(中国)有限公司]分别测定CHB患者组和对照组ANA、抗肝肾微粒体抗体(liver kidney microsomal antibody，LKM)、抗肝细胞溶质抗原Ⅰ型(liver cytosolic 1，LC1)抗体、抗平滑肌抗体(anti-smooth muscle antibody，ASMA)和抗线粒体抗体(antimitochondrial antibody，AMA)，Olympus荧光显微镜下判断结果，ANA同时区分核型。标本起始检测效价为1∶100，如细胞不显示特异性荧光，则判为阴性。如细胞显示特异性荧光模型，则继续做1∶320、1∶1000的稀释，至细胞不显示特异性荧光。

结 果

1.CHB组与对照组外周血Tfh细胞相关表达分子分析：CHB组CXCL13、CXCR5、TGF-β2和IL-21均明显高于对照组，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)，详见表1。

表1 CHB组与对照组外周血CXCL13、CXCR5、TGF-β2和IL-21的比较

2.CHB组与对照组外周血自身抗体测定：CHB组自身抗体阳性率(26%)明显高于健康对照组(3.33%)，差异有统计学意义(P<0.05)，荧光强度以低效价(1∶100)为主(占76.9%)。ANA阳性荧光核型表现为核颗粒型7例，胞质颗粒型1例，胞质纤维型1例和1例混合核型(核仁型和核颗粒型)，对照组检测有1例ANA阳性，其荧光核型表现为核颗粒型(1∶100)。CHB组ASMA抗体阳性率为6%，未检出AMA抗体、LC1抗体和LKM抗体，对照组未检出此4种抗体,详见表2。

表2 CHB组与对照组自身抗体结果比较[n(%)]

3.CHB患者自身抗体阳性者与阴性者Tfh细胞相关表达分子表达差异：对13例自身抗体阳性的CHB患者与其余37例自身抗体阴性的CHB患者的CXCL13、CXCR5、TGF-β2和IL-21进行比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，详见表3。

表3 CHB患者自身抗体阳性者与阴性者Tfh细胞相关表达分子的表达差异

讨 论

目前认为，效应Tfh细胞与高亲和力B细胞的相互作用促进了生发中心的形成和维持，促使B细胞增殖、抗体类别转换，以及分化成为浆细胞和记忆性B细胞，导致某类高效价自身抗体的产生，机体体液免疫应答发生紊乱[6，7]。因此，Tfh细胞功能正常与否是决定机体抗体免疫应答发生的主要因素[8]。在本研究中，CHB患者外周血中CXCR5和其配体CXCL13表达水平明显高于健康对照组，提示HBV感染人体后可引起Tfh细胞增殖，从而使外周血中CXCR5、CXCL13表达增加，并参与HBV所介导的免疫反应。Liu等[9]研究还发现，CXCL13的水平与替比西林治疗期间HBV的免疫控制有关。CHB患者组外周血中IL-21表达水平明显高于健康对照组，表明HBV感染人体后引起Tfh细胞分泌IL-21增多，其能进一步诱导浆细胞的分化，分泌更多相应的免疫球蛋白，同时通过Tfh细胞自身表达的IL-21R，也可诱导Tfh细胞分化，并促进其表面 CXCR5、ICOS 的表达[10]。TGF-β是一种多功能的细胞因子，可以调节多种细胞的生长、分化及凋亡等，也可促进细胞外基质合成[11]。TGF-β可分为TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，有研究表明，TGF-β2有诱导晶状体上皮细胞凋亡，促进骨髓间充质干细胞成骨分化，辅助B细胞增殖、成熟，发生抗体类别转换等作用[12～14]。本研究中CHB组外周血TGF-β2表达水平也明显增高，显示HBV感染人体后能刺激机体细胞产生更多的TGF-β2，增多的TGF-β2和IL-21协同作用促进初始B细胞增殖和分化，发挥机体免疫应答以及清除病毒的作用[14]。

HBV感染常伴随自身免疫表现和(或)自身免疫性疾病，患者体内出现自身抗体，从而可能引起肝外和肝内组织的免疫损伤，加重患者的临床表现。但目前报道的自身抗体出现的频率不一，检测到的自身抗体种类也不尽相同[15～18]。本研究中CHB患者ANA的阳性率与Li等[17]研究结果基本一致，ASMA阳性率则略高于谭朝霞等[18]的研究结果，其余AMA、LC1抗体和LKM抗体阳性率与其研究基本一致。CHB组和对照组之间的自身抗体阳性率比较，差异有统计学意义，可见这些自身抗体的频率增加与HBV的慢性感染有关，患者体内免疫功能已出现紊乱。自身抗体总阳性率较Acay等[15]和Sener等[16]的研究结果略高，较Li等[17]的研究结果低，可能与入组CHD患者所处的感染不同状态以及检测的自身抗体类型与数量不同有关。Li等[17]研究的CHB患者中抗Ro52抗体就有28%的阳性率，也有报道在干扰素等药物治疗后CHB患者体内自身抗体的检出率更高，而且自身抗体的检出率也有随病情发展而增高的趋势，与肝功能损害的程度及HBV病毒复制水平相关[19～23]。

ANA免疫荧光核型可分为多种，常见包括核均质型、核颗粒型、核仁型、核点型、核膜型、着丝点型、胞质颗粒型、胞质纤维型等，不同的核型对应的靶抗原不同。本研究CHB患者的核型表现以核颗粒型为主(70%)，另有混合核型(核仁型和核颗粒型)占10%，且荧光效价为1∶320，Sener等[16]的研究中荧光核型也以核仁型(37.5%)和核颗粒型(25%)为主。核仁型有随病情的衍变而增高的趋势，提示在慢性肝病衍变过程中自身免疫的变化可能多集中在与细胞增殖、分裂有关的核仁成分上[18]。

本研究表明，CHB患者体内存在自身免疫紊乱现象，其Tfh细胞相关表达分子CXCL13、CXCR5、TGF-β2和IL-21也明显高于对照组，因此对自身抗体阳性的CHB患者和自身抗体阴性的CHB患者的CXCL13、CXCR5、TGF-β2和IL-21分别进行比较分析，差异无统计学意义，表明本研究中CHB患者体内自身抗体的出现与Tfh细胞相关表达分子CXCL13、CXCR5、TGF-β2和IL-21的关联性并不强。但本研究只观察了CHB患者中ANA、ASMA、AMA、LC1抗体和LKM抗体等6种与肝脏疾病有较大关联的自身抗体，而且CHB患者中自身抗体阳性组只有13例，例数偏少，尚不能代表总体数据，有待于进一步扩大样本量，同时观察其他更多种类的自身抗体进行深入地研究。