ANKRD13A在肝癌组织中的表达及对其生物学行为的影响

生 禹 吴书桢 葛思佳 陈 婧 刘肇修 黄 伟 陆翠华

原发性肝癌是我国第4位常见的恶性肿瘤及第2位的肿瘤致死病因,包括肝细胞癌、肝内胆管癌和混合型肝细胞癌-胆管癌3种病理学类型,其中肝细胞癌(简称肝癌)占75%～85%[1,2]。我国每年新发的肝癌数量占全球肝癌发病数的一半以上,由于肝癌早期诊断较为困难,绝大多数患者发现时已处于肝癌进展期甚至已经有其他脏器的受累,这进一步导致肝癌的预后不佳[3,4]。因此,深入研究肝癌发生、发展的机制,寻找有效的预防和治疗的措施,是当前肝癌研究的热点和关键点。

ANKRD13家族包括ANKRD13A、13B和13D,该蛋白家族分子结构中含有多个高度保守的泛素相互作用基序(ubiquitin-interacting motif,UIM)。研究表明,ANKRD13A可通过其UIM结构域与一些内吞蛋白相互作用,从而阻止后者内化,在miR-204介导下ANKRD13A可抑制晶状体上皮细胞的迁移[5～7]。ANKRD13A与卵巢癌患者的预后有着显着的相关性,但是ANKRD13A在肝癌发生、发展过程中的作用及分子机制鲜见报道[8]。本研究旨在探讨ANKRD13A在肝癌组织中的表达情况以及对肝癌细胞生物学行为的影响以及可能的分子机制,以期为肝癌的临床诊断及治疗提供新思路。

材料与方法

1.一般资料:选取南通大学附属医院2012年1月～2021年5月收集的肝癌组织和相对应的癌旁组织(n=20)。由南通大学附属医院研制了含有106例肝癌样本的人体组织芯片。所有样本均来自于手术切除,所有组织术后均经病理确认。本研究通过笔者医院医学伦理学委员会审查(伦理学审批号:2015-045),所有患者均知情同意。

2.细胞培养及传代:人肝癌细胞株SMMC- 7721来源于中国科学院细胞库(上海),将肝癌细胞按要求放入含10%-胎牛血清的培养基(DMEM)中培养,置入恒温培养箱,每2天换液1次,待细胞融合至70%～80%时进行细胞传代,取对数期的细胞用于后续试验。

3.细胞转染:过表达质粒和对照质粒购自武汉淼灵生物科技有限公司。根据试剂说明书用Lipofectamine 2000将质粒转染到目标细胞系中,48h后弃除转染液使用正常培养基培养,并用嘌呤霉素筛选转染过表达ANKRD13A质粒和空载质粒的SMMC-7721细胞10～14天,成功构建含目标质粒的稳转细胞系。

4.免疫组织化学染色(IHC):组织固定后包埋,制作连续切片(厚4μm),然后用二甲苯脱蜡,抗原修复,接着加入ANKRD13A一抗抗体,置入4℃冰箱过夜,加入二抗,室温烘烤30min后PBS洗涤3次,二氨基联苯胺显色10min,苏木精复染,显微镜拍照。根据阳性染色强度和肿瘤细胞染色比例进行评分(0分: 0～5%,1分: 6%～30%,2分: 31%～70%, 3分:>71%)。Thomas综合计分法计算结果:0～7 分为阴性表达(-),8～12 分为阳性表达(+)。

5.Western blot法检测:收取各组细胞,肝癌和癌旁组织分别加入等比例的RIPA 裂解液,提取总蛋白,调整好上样量,SDS-PAGE电泳分离后转印至PVDF膜上,使用5%脱脂牛奶封闭2h后,加入ANKRD13A、ERK1/2、p-ERK1/2、MEK、p-MEK一抗置入4℃冰箱敷育过夜,后取出用PBS清洗,加入IgG二抗室温敷育2h,继续用PBS清洗,应用显影液避光显影, 凝胶成像系统曝光拍照,并通过ImageJ软件进行量化。

6.实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测: 将TRIzol试剂1ml分离加入已称量好的肝癌组织和癌旁组织(100mg)静置10min,再加入氯仿200μl,振荡混匀后,12000r/min离心15min,取上清液加入等体积的异丙醇,混匀后再次离心去下层沉淀,用乙醇洗涤后,加入DEPC溶解,分光光度计测量RNA浓度。将1μg的RNA反转录为cDNA,进行PCR扩增。ANKRD13A上游引物:5′-TGCACCTCCTAGTCTGGAAAA-3′,下游引物:5′-AGATGCAATAATGTTCGACCTCG-3′。ETS上游引物:5′-GTGGCCAGGAGATGGGGAAA-3′,下游引物:5′-CATGGCGTGCAGCTCTTCAG-3′。c-Myc上游引物:5′-CGTCTCCACACATCAGCACAA-3′,下游引物:5′-CACTGTCCAACTT GACCCCTCTTG-3′。Elk-1上游引物:5′-TCCCTGCTTCCTACGCATACA-3′,下游引物:5′-GCTGCCACTGGATGGAAACT-3′。内参18S上游引物:5′-CGCCGCTAGAGGTGAAATTC-3′,下游引物:5′-CCAGTCGGCATCGTTTATGG-3′。反应条件:95℃ 5min, 95℃ 10s, 60℃ 30s, 40 个循环。每个样本重复 3 次,计算平均值,所有步骤均符合MIQE规则。

7.CCK-8实验:将各组别的细胞以 5000 个/孔接种于 96 孔板中,分别培养 0、24、48、72h,在对应的时间点向每孔中分别加入 10μl CCK-8试剂,置入恒温培养箱避光孵育2h后,取出培养板放置于酶标仪检测450nm处的吸光度(A)值。

8.Transwell实验:在各组别的细胞分别计数两万个重悬于200μl无血清的培养基(DMEM)中,加入到预选准备的小室上室中,将含 10%胎牛血清的600μl培养基添加到下室,置入恒温培养箱敷育48h后,取出小室使用多聚甲醛固定,结晶紫染色,后于显微镜下计数迁移到滤膜下的肿瘤细胞。

9.划痕愈合实验:将各组别的细胞接种于6孔板中,置入恒温培养箱培养,后取出6孔板弃出培养基,用200μl的枪头垂直于6孔板作直线划痕,分别于划痕后0h和24h拍摄所划区域细胞迁移图像,记录分析比较各组之间的差异。

结 果

1.ANKRD13A在肝癌组织中低表达:与对应的癌旁组织比较,ANKRD13A在肝癌组织中的表达水平显着降低(图1中A～C)。进一步根据ANKRD13A在肝癌组织芯片中的染色情况,将患者分为高表达组(n=27)和低表达组(n=72),分析ANKRD13A蛋白的表达水平与患者临床病理参数之间的相关性。统计分析显示,ANKRD13A蛋白的表达水平与患者的BCLC分期(P=0.001)以及是否存在肝硬化(P=0.003)显着相关,而与患者的年龄、性别、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)水平、乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen,HBsAg)以及有无远处转移等临床病理参数无显着相关(表1)。同时,在CPTAC数据库中分析发现,与癌旁组织比较,ANKRD13A蛋白在肝癌组织中的表达水平显着降低(P<0.001),差异有统计学意义(图1D)。以上结果提示,在肝癌的发生、发展过程中,ANKRD13A蛋白可能发挥了重要的抑制作用。

图1 ANKRD13A在肝癌组织中低表达A.Western blot法检测ANKRD13A蛋白在3例肝癌组织和癌旁组织中的表达差异;B.RT-qPCR检测ANKRD13A mRNA在30例肝癌组织和癌旁组织中表达差异;C.ICH检测ANKRD13A蛋白在肝癌组织和癌旁组织中的表达情况;D.ANKRD13A蛋白在CPTAC数据库中的表达情况。GAPDH为内参

表1 ANKRD13A蛋白的表达水平与患者临床病理参数之间的相关性

2.过表达ANKRD13A可显着抑制肝癌细胞在体外的增殖和迁移活力:为了进一步探究ANKRD13A对肝癌细胞生物学行为的影响,本研究构建了稳定过表达ANKRD13A或对照质粒的SMMC-7721细胞系(图2A)。通过CCK-8细胞增殖实验发现,在SMMC-7721细胞中过表达ANKRD13A可显着抑制细胞的体外增殖活力(图2B)。同时,通过细胞划痕愈合实验和Transwell迁移实验发现,过表达ANKRD13A也可显着抑制肝癌细胞的体外迁移能力(图2中C～F)。以上结果表明,在体外细胞模型中,过表达ANKRD13A可显着抑制肝癌细胞的增殖和迁移能力。

图2 过表达ANKRD13A可抑制肝癌细胞在体外的增殖和迁移能力A.Western blot法验证成功构建稳定过表达ANKRD13A和对照质粒的SMMC-7721细胞系;B.CCK-8细胞增殖实验探究过表达ANKRD13A后对SMMC-7721细胞增殖活性的影响;C、D.细胞划痕实验探究过表达ANKRD13A后对SMMC-7721细胞迁移速度的影响;E、F.Transwell细胞迁移实验探究过表达ANKRD13A后对SMMC-7721细胞迁移能力的影响。GAPDH为内参,*P<0.01,**P<0.001

3.过表达ANKRD13A 可抑制肝癌细胞在裸鼠体内的生长:为了进一步验证ANKRD13A 对肝癌细胞增殖能力的影响,将过表达ANKRD13A 或对照组的SMMC-7721细胞注射到裸鼠皮下(图3A),每周测量裸鼠皮下肿瘤的体积,4周后处死裸鼠并取出肿瘤组织进行称量,结果显示,过表达ANKRD13A组裸鼠皮下肿瘤的生长速度以及肿瘤重量和体积均较对照组显着降低(图3中B、C)。将取出的肿瘤组织进一步进行增殖细胞相关的核抗原ki-67染色,结果发现,与对照组比较,过表达ANKRD13A组肿瘤细胞的ki-67染色减弱(图3D)。以上结果表明,过表达ANKRD13A可显着抑制肿瘤细胞在小鼠体内的增殖。

图3 过表达ANKRD13A可显着抑制肝癌细胞在裸鼠体内的生长能力A.左图为裸鼠皮下成瘤的大体图像;左侧为对照组,右侧为过表达ANKRD13A组;右图为裸鼠肿瘤的大体图像:上一排为对照组,下一排为过表达ANKRD13A组;B.肿瘤重量;C.肿瘤体积;D.两组裸鼠皮下肿瘤切片的ki-67染色。*P<0.05

4.ANKRD13A可能通过抑制MEK磷酸化发挥其生物学效应:细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)信号通路是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族中的一条信号通路,包括ERK1和ERK2两个重要成员。ERK1/2受上游特异性刺激分子MEK1/2的双磷酸化而激活,磷酸化的ERK1/2形成二聚体,从细胞质移位到细胞核,进而磷酸化一系列下游转录因子,例如c-Myc、stat、SAP-1等,从而调控细胞周期和生存等过程[9]。本研究中,为了初步探究ANKRD13A调节肝癌细胞生物学行为的可能分子机制,笔者利用Western blot法检测了ERK1/2信号通路相关蛋白的活化水平,结果发现,过表达ANKRD13A可抑制肝癌细胞中ERK1/2的磷酸化水平,并且可显着抑制其上游MEK1/2蛋白的磷酸化水平(图4A)。同时,通过RT-qPCR实验发现,ERK1/2信号通路的下游转录因子c-Myc、Elk-1、ETS的表达水平也显着降低(图4B)。既往研究表明,在肿瘤相关疾病中,MEK信号通路参与调控肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移能力。例如,MEK抑制剂曲美替尼能够降低甲状腺癌的增殖能力,并且对非小细胞肺癌有一定的治疗效果[10]。本研究发现,过表达ANKRD13A可显着抑制肝癌细胞中MEK1/2的磷酸化水平,从而影响其下游的ERK1/2的磷酸化以及细胞核中转录因子的表达,但是有关ANKRD13A抑制MEK1/2磷酸化的分子机制有待于进一步探究。

图4 在肝癌细胞中ANKRD13A可能通过抑制MEK1/2磷酸化发挥其生物学效应A.Western blot法检测p-MEK1/2、MRK1/2、p-ERK1/2、ERK1/2的表达水平;B.RT-qPCR检测ERK1/2下游转录因子c-Myc、Elk-1、ETS等的表达水平变化。GAPDH为内参,*P<0.001

讨 论

肝癌是一种高度恶性肿瘤,其发病机制一直是临床研究的重点和热点[11]。肝癌的高度侵袭性与肝癌细胞的增殖和迁移能力密切相关[12]。因此寻找一个早期的诊断指标和新的治疗靶点尤为重要。

ANKRD13A是表皮生长因子受体相互作用蛋白,其可通过自身分子结构域C端的3个锚蛋白重复序列与相关细胞膜上配体激活的泛素化EGF受体部分结合来调节细胞表面物质的内吞反应,从而进一步介导相关蛋白质之间的相互作用[13]。同时ANKRD13A可以诱导束状肌动蛋白的分解,微管的径向分布和脂肪酸分布以及细胞黏附性的增加,其在细胞骨架和脂肪组织中起着关键作用[7]。肿瘤细胞的形成与细胞迁移和增殖有着密不可分的关系,而ANKRD13A在一定程度上可以调控相关细胞的迁移。研究发现,ANKRD13A参与了急性白血病的发生、发展,其在该类肿瘤的形成过程中发挥重要作用[14]。但ANKRD13A在肝癌中的发生机制尚不明确,因此本文对ANKRD13A的相关分子机制进行研究。

Ras-MEK通路是癌细胞生物学中特征最为明显的激酶级联反应之一,它是由生长因子中的致癌激酶的激活突变触发的,在几种癌症的发生、发展和维持中发挥着核心作用,包括黑色素瘤、胰腺癌、肺癌、结肠直肠癌和乳腺癌。既往还有研究报道,该通路在肝癌中特异性上调,并且通过细胞表面受体和细胞质信号产生的增殖信号传递到细胞核,从而驱动癌细胞增殖和进展[15]。

本研究发现,过表达ANKRD13A可显着降低MEK1/2的磷酸化水平,并且抑制其下游转录因子的表达水平。因此,笔者猜测在肝癌细胞中,ANKRD13A可能通过抑制MEK1/2的磷酸化,进而抑制细胞的增殖与迁移能力。本研究通过比较30例肝癌患者的癌组织和癌旁组织中ANKRD13A的mRNA水平,发现ANKRD13A在癌旁组织中的表达水平显着高于癌组织。并且发现在癌组织中,其蛋白水平也显着降低。进一步研究发现,过表达ANKRD13A可显着抑制肝癌细胞的增殖与迁移能力。以上结果提示,ANKER13A在肝癌的发生、发展过程中具有重要的抑制作用。然而本实验存在一定的不足,仅初步发现ANKRD13A可以调控MEK1/2的磷酸化,并影响其下游分子,但是否存在与之相互作用分子共同调节该通道的具体机制仍值得深入探讨。

综上所述,本研究表明,ANKRD13A可能通过抑制MEK1/2的磷酸化,进而抑制肝癌细胞的增殖与迁移能力,在肝癌的发生、发展过程中发挥了重要的抑制作用。本研究有望为肝癌发病机制的研究及肝癌治疗靶点的研发提供新思路。