胡海龙 吴长利 孙 岩 张文岚 韩瑞发

膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一，95%以上的膀胱癌是膀胱移行细胞癌，其生物学行为多变，肿瘤大小、分级、分期、复发、转移等与预后密切相关[1]。肿瘤的发生发展与细胞周期调节失控密切相关。如果细胞周期调控发生异常，受损害的DNA得不到及时修复，细胞继续分裂，因遗传不稳定，可转变为癌细胞。E2F3转录调节因子是在细胞周期调控过程中起重要作用的调控蛋白。本研究旨在探讨膀胱移行细胞癌中E2F3表达与其生物学行为的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 免疫组化标本选用我院2003年4月—2006年4月手术切除的74例膀胱黏膜组织存档蜡块并经病理证实。术前均未行放疗、化疗与免疫治疗。其中膀胱移行细胞癌组 64例，男49例，女15例；年龄 34～86 岁，平均（51.4±28.8）岁。按照WHO膀胱肿瘤组织学分类标准（1999）分级：G112例，G228例，G324例；TNM 分期：Ta～142例；T2～422例。正常黏膜组10例，均为前列腺增生开放性手术时留取，年龄48～72岁，平均（58.6±18.4）岁。2组间年龄差异无统计学意义（t＝ 1.068，P＞0.05）。RT－PCR检测所需标本为 2005年10月—2006年10月间膀胱移行细胞癌组织标本52例，男33例，女19例；年龄 34～86 岁，平均（52.0±27.6）岁。对照组为同期正常膀胱黏膜 10例，年龄 47～76 岁，平均（71.2±9.4）岁，2 组间年龄差异无统计学意义（t＝ 1.106，P ＞ 0.05）。

1.2 方法

1.2.1 E2F3 mRNA的半定量分析 应用TRIZOL进行组织中总RNA的提取，RNA质量经紫外分光光度计测定，并应用甲醛凝胶电泳观察其降解情况。应用两步法RT-PCR试剂盒逆转录合成cDNA并进行PCR扩增及鉴定：在20 μL逆转录体系中加入组织总RNA 1 μg，然后加入寡脱氧胸苷酸、三磷酸脱氧核苷、RNA酶抑制剂、逆转录酶、逆转录缓冲液加水至 20 μL，混匀后 38 ℃ 2 h，95 ℃ 2 min。50 μL PCR 反应体系加入 cDNA 1 μL、PCR 缓冲液、Taq酶、dNTP、E2F3和GAPDH引物各一对及三蒸水，在PCR上扩增。取5 μL PCR产物与0.5 μL加样电泳缓冲液混匀后，点于电泳孔中，5 V/cm电压进行电泳，1 h后关闭电源。将凝胶放于Kodak 440凝胶成像分析系统上成像，分别获得各电泳条带上E2F3和GAPDH电泳条带的平均光密度（mean optical density，MOD）数值，并将二者数值相比，进行E2F3 mRNA表达的半定量分析。

1.2.2 组织切片的制备及E2F3免疫组化染色 选出典型的肿瘤组织标本蜡块，连续切片6张，厚4 μm，于35℃～40℃恒温水浴锅的水面上完全展开。除1张做HE染色外，其余均用经APES（防脱片剂）处理的玻片捞片并标记，于65℃恒温烤箱中烤片6 h，自然冷却后装盒备用。染色玻片经病理医师复查、核实病理诊断与分级。采用即用型二步法（En Vision）免疫组织化学方法。其中一抗E2F3为鼠抗人单克隆抗体，稀释度为1∶100。操作步骤按照超敏非生物素检测试剂盒PV-9000步骤实施，用PBS代替一抗作阴性对照，用已知的基因表达组织片作阳性对照。

1.2.3 结果判定 免疫组化产物阳性呈浅黄色-棕褐色细颗粒状。每例切片均随机观察5个高倍视野（×400），计数1 000个细胞，计算阳性细胞所占的百分比。按阳性细胞所占的百分比评分：0分为阳性细胞＜5%，1分为阳性细胞5%～24%，2分为阳性细胞25%～49%，3分为阳性细胞50%～74%，4分为阳性细胞≥75%。按染色强度评分：0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。染色强度与阳性细胞百分比评分的乘积≤1分为表达阴性，2～12分为阳性。E2F3表达阳性石蜡切片置于Olympus显微镜下观察细胞内棕黄色为阳性信号。手动连续取5个高倍视野。由摄像系统提取数值化细胞图像输入Image-pro plus形态学图像分析系统定量分析。计算每视野阳性染色的积分光密度（integrated optical density，IOD）值，并取5个视野的积分光密度平均值作为分析数据。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0对实验数据进行统计学处理，3组样本以上计量资料用方差分析，多样本均数间的多重比较用Dunnett-t检验，计数资料用χ2检验分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱正常黏膜及膀胱移行细胞癌组织中E2F3蛋白的表达 免疫组化产物阳性呈浅黄色-棕褐色细颗粒状，E2F3蛋白定位于细胞核，偶见于细胞浆，见图1。在膀胱移行细胞癌中E2F3的阳性表达率为37.5%（24/64），阳性表达程度IOD为（6.569 8±3.227 5）×104，正常膀胱黏膜则无表达。不同组织学分级和病理分期患者E2F3蛋白阳性表达情况，差别有统计学意义（P<0.01），见表1。不同性别、年龄、肿瘤数目、复发情况患者E2F3蛋白阳性表达情况，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 E2F3在膀胱移行细胞癌组织中的表达（×100）

2.2 膀胱正常黏膜及膀胱移行细胞癌组织中E2F3 mRNA的表达 5 S、18 S、28 S核糖体 RNA条带清晰，18S、28S两者条带之比约为2∶1，说明所提取的样品总RNA具有完整性，见图2。各凝胶在成像分析系统上成像，可见E2F3（243 bp）和GAPDH（492 bp）2条电泳带，其中内参GAPDH在不同恶性程度的膀胱癌和正常膀胱黏膜中均有表达，且表达量大致相等；而E2F3仅在部分膀胱癌组织中有表达，在正常黏膜中无表达，见图3。不同临床病理特征患者间E2F3 mRNA水平比较结果与蛋白阳性表达情况相符，见表1。

表1 膀胱移行细胞癌组织中E2F3蛋白及E2F3 mRNA表达与临床病理特征的关系

图2 不同膀胱组织中总RNA甲醛变性凝胶电泳

图3 E2F3 mRNA在不同膀胱组织中的表达情况

3 讨论

膀胱癌的发生必须有多种致癌因素长期在细胞内作用，导致原癌基因的激活，继而经过一系列复杂的信号转导过程最终影响细胞周期的运转。在复制及转录过程中又因为抑癌基因的缺失或失活不能修复受损的DNA，也不能使细胞进入正常的凋亡过程，从而使携带有异常DNA的细胞无限制复制，最终导致膀胱癌的发生。

人类膀胱癌中不同染色体部位存在多种DNA的改变，包括一些基因的失活如 RB、TP53、和INK4A/ARF等；还包括一些基因的扩增与过表达如MDM2、CCND1/Cyclin D1和ERBB2及一些基因的突变激活如H-RAS及FGFR3等。Simon等[2]通过比较基因组杂交（CGH）研究膀胱癌染色体的调节区曾多次发现在染色体6p22处有基因的扩增。Evans等[3]用多重定量聚合酶链反应分析59例膀胱癌也精确定位染色体6p22处有基因扩增。Veltman等[4]在研究膀胱癌的基因扩增和过表达时认为6p22处扩增的基因为E2F3。Feber等[5]用CGH分析cDNA微序列对膀胱癌的细胞系进行筛选，得到3种膀胱癌细胞系（TCCSUP、5637和 HT1376）中染色体6p22处存在基因扩增，同时发现基因扩增的高峰区为一段6.5 Mb含有12个基因的区域，该区域跨越E2F3基因位点。

E2F3属于E2F家族，定位于染色体6p22，全长91.5 kb，其编码的E2F3转录蛋白由465个氨基酸组成，分子质量49 ku。它参与调控细胞周期与DNA复制并与多种致癌和抑癌基因有联系[6]。E2F3的激活受到pRB蛋白的调控，pRB与E2F3在细胞周期G1期结合，继而抑制了E2F3的转录活性。

本研究发现在正常膀胱黏膜中E2F3无表达，在移行细胞癌组织中的表达率很高，且与膀胱癌的组织学分级及临床分期关系密切。随着肿瘤数目增多及肿瘤复发，E2F3的表达也有上升趋势，但差异无统计学意义。Leone等[7]曾报道膀胱癌中染色体6p22处扩增子与肿瘤分级程度有关。Feber等[5]的研究也表明随着肿瘤分期的增加，E2F3的表达显着增加，差异有统计学意义。这些与本文的研究结果一致，由此可见，E2F3的过表达与膀胱癌细胞分化程度和浸润深度有关。

E2F3处于细胞周期调控的核心环节，其高表达可致肿瘤细胞异常增殖，而凋亡受到限制。如果肿瘤细胞中E2F3基因表达降低，膀胱肿瘤细胞是否会发生与E2F3高表达相反的效应，是否能够抑制肿瘤细胞的增生并促进其凋亡仍未明了。笔者已经构建了针对E2F3基因的质粒干扰载体[8]，并将通过后续的以E2F3为靶点的膀胱癌基因沉默体外试验来探讨上述问题。

[1]Oosterlinck W.Guidelines on diagnosis and treatment of superficial bladder cancer[J].Minerva Urol Nefrol,2004,56(1):65-72.

[2]Simon R,Burger H,Semjonow A,et al.Patterns of chromosomal imbalances in muscle invasive bladder cancer[J].Int J Oncol,2000,17(5):1025-1029.

[3]Evans AJ,Gallie BL,Jewett MA,et al.Defining a 0.5-mb region of genomic gain on chromosome 6p22 in bladder cancer by quantitative-multiplex polymerase chain reaction[J].Am J Pathol,2004,164(1):285-293.

[4]Veltman JA,Fridlyand J,Pejavar S,et al.Array-based comparative genomic hybridization for genome-wide screening of DNA copy number in bladder tumors[J].Cancer Res,2003,63(11):2872-2880.

[5]Feber A,Clark J,Goodwin G,et al.Amplification and overexpression of E2F3 in human bladder cancer[J].Oncogene,2004,23(8):1627-1630.

[6]Oeggerli M,Schraml P,Ruiz C,et al.E2F3 is the main target gene of the 6p22 amplicon with high specificity for human bladder cancer[J].Oncogene,2006,25(49):6538-6543.

[7]Leone G,De Gregori J,Yan Z,et al.E2F3 activity is regulated during the cell cycle and is required for the induction of S phase[J].Genes Dev,1998,12(14):2120-2130.

[8]胡海龙，吴长利，孙岩，等.pRNAT-U6.1/Neo系统在E2F3基因RNA干扰载体构建中的应用[J].天津医药,2009,37(10):829-831.