王娉婷 佟雪璐 陈新梅
目前约有18种基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）家族成员可以在正常牙髓组织中检测到[1]。有研究发现，在炎症牙髓组织中，明胶酶MMP-9的水平有所增高[2]，提示其作为降解细胞外基质的主要酶系，可能在牙髓炎症过程中发挥着重要作用[3]。而其产生作用的具体途径和机制目前尚不明确。由于细胞因子是MMPs酶原合成阶段最主要的调节因素，而其中的白细胞介素（interleukin，IL）-1是牙髓炎症过程中最关键的介质之一[4]。本研究利用免疫组化技术和明胶酶谱分析检测经IL-1β刺激的人牙髓成纤维细胞中MMP-9的表达和活性，初步探索在牙髓组织中IL-1β对MMP-9的合成和分泌的影响，为进一步研究MMPs在牙髓炎症中的作用机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 细胞培养及接种 收集2006年4月—6月在四川大学华西口腔医院因正畸原因完整拔除的健康前磨牙12颗，患者年龄18～25岁，无全身系统性疾病及关节炎病史。按以下方法培养原代牙髓成纤维细胞：75%乙醇擦拭拔除牙表面，用青、链霉素双抗液浸洗，于超净工作台（苏州净化设备有限公司）上劈开牙齿，取出牙髓，并剪掉根尖端1/3部分。将牙髓组织剪成1～2 mm3大小组织块，移入离心管中，加入3 g/LⅠ型胶原酶（Sigma-Aldrich公司，美国）约3 mL，37℃摇床消化45～50 min后，1 000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀中加入含有20%胎牛血清（Hyclone公司，美国）的高糖DMEM培养基（Gibco公司，美国）重新悬浮沉淀，接种至培养瓶，置于37℃、5%CO2培养箱（SANYO-Mco17AIC，日本）静置培养。取12例样本源中细胞生长最为旺盛者用于传代培养，传代培养方法如下：待原代细胞贴壁后，隔日半量换液；细胞汇合后，采用胰蛋白酶消化法收集细胞，按1∶2传代。选取生长良好的4～8代细胞，胰蛋白酶消化，镜下计数，调整细胞密度为1×104/孔，接种于预先放置载玻片的6孔板中，置于培养箱中备用。
1.2 免疫组化实验 6孔板中每个孔内的牙髓成纤维细胞为一个样本，设实验组和对照组各20个样本。实验组待细胞汇合至80%后，换为无血清培养基，同时加入IL-1β（PeproTech EC公司，英国），使其终浓度为10 μg/L，继续孵育48 h后，多聚甲醛固定待检；对照组更换培养基时不加入IL-1β，其余操作同实验组。将2组样本采用链霉素抗生素蛋白-过氧化酶免疫组化法（streptavidin peroxdase conjugated method，SP）处理：固定后的样本滴加5%牛血清白蛋白（BSA）封闭液，室温静置20 min并去除多余液体后，滴加1∶150倍稀释的兔抗人MMP-9单克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司），4℃下反应过夜后用PBS清洗。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃下反应30 min后用PBS清洗。滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，反应30 min后用PBS清洗。3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）显色、苏木素复染、明胶甘油封片后在倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）下观察。用乳腺癌阳性片作阳性对照，用PBS代替第一抗体作阴性对照，MMP-9染色阳性细胞为胞质内出现红色颗粒，无着色即为阴性。每张细胞爬片显微镜下随机读取5个视野（×200），分别观察实验组和对照组中阳性细胞的比例，参考Nagel等[5]的方法进行分类：无阳性细胞为阴性，染色阳性细胞数<10%为弱阳性，10%～50%为中等阳性，>50%为强阳性。分别计数2组的分布频数。
1.3 明胶酶谱实验 与免疫组化实验相同，6孔板中每个孔内的牙髓成纤维细胞为一个样本，设实验组和对照组各20个样本，分别对实验组和对照组进行如下处理：实验组待细胞汇合至80%后，换为含10%血清的培养基同时加入终浓度为10 μg/L的IL-1β，每隔48 h更换培养基以及IL-1β，分别收集第2、4、6、8、10天的细胞培养上清液于微量离心（EP）管中，-80℃保存待检；对照组更换培养基时，不加入IL-1β，其余操作同实验组。配制8%分离胶和3.9%浓缩胶，以20 μL样品上样，以经蛋白变性后的低分子质量蛋白标准品（华美生物工程公司）为阳性对照，该标准品含兔碳酸酐酶、牛血清白蛋白、兔肌动蛋白、牛碳酸酐酶、胰蛋白酶抑制剂、鸡蛋清溶菌酶，分别表达为相对分子质量97 400，66 200，43 000，31 000，20 100，14400的6条条带；以上样缓冲液为阴性对照。在垂直电泳槽和电泳仪（Bio-Rad公司，美国）上以80 V、20 mA电泳30 min后，改为150 V，20 mA，电泳80 min。取出胶体置于2.5%Triton X-100（华美生物工程公司）洗脱液中震荡30 min，重复2次。加入明胶缓冲液，37℃孵育48 h。考马斯亮兰染色4 h，脱色，至出现明显清晰的负染酶带。用蒸馏水漂洗后观察，通过计算机扫描图像，Image-Pro Plus 6.0软件测量累积光密度值（integrated optical density，IOD）。
1.4 统计学处理 应用SPSS 12.0统计软件包进行分析。对免疫组化实验结果，采用小样本计数资料检验方法Mann-Whitney秩和检验比较实验组与对照组的差异；对正态分布的计量资料以±s表示，并对每个观测时间点的2组IOD值之间的差异采用t检验进行比较。检验水准为双侧α=0.05。
2 结果
2.1 免疫组化结果 倒置相差显微镜下可见，在对照组人牙髓成纤维细胞中，大部分样本中MMP-9的表达为阴性，见图1，或者阳性细胞数<10%，仅个别样本阳性细胞数为10%～50%。MMP-9染色阳性颗粒零散分布于细胞胞浆中，未见阳性细胞数>50%的样本。实验组的人牙髓成纤维细胞中，染色阳性颗粒主要分布于细胞胞浆中，少量分布于细胞外基质中，见图2。MMP-9阳性表达率明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.01），见表1。
Table 1 Results of immunohistochemistry between two groups表1 免疫组化法检测结果 （n=20，例）
2.2 明胶酶谱分析 对照组和实验组中均可检测到MMP-9的酶原形式（分子质量92 ku），而并未检测到活化形式的MMP-9（分子质量83 ku），见图3、4。上清液中MMP-9表达对照组及实验组IOD值随培养时间的推移变化均不明显，在所观测的5个时间点，实验组细胞MMP-9表达的IOD值均高于对照组，差异有统计学意义（均P<0.01）。
3 讨论
在生理状态下，牙髓中MMPs的水平较低，其与基质金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）的平衡维持着牙髓组织的健康，而在炎症牙髓组织中，一些MMPs的水平有所增高，其与TIMPs的平衡被打破，造成牙髓组织细胞外基质的降解，尤其是胶原的降解。MMP-9即为炎症牙髓中表达水平升高的MMPs之一，其主要定位在成牙本质细胞及牙髓成纤维细胞的胞浆中，且在某种程度上与牙髓炎患者的主观症状相关，提示MMP-9可能在牙髓炎症过程中发挥着重要作用，而目前对其作用机制和途径尚不十分清楚。
Table 2 IOD values of gelatin zymogram of MMP-9 level in human pulp fibroblasts表2 人牙髓成纤维细胞中MMP-9水平的明胶酶谱IOD值 （n=20，×103，±s）
Table 2 IOD values of gelatin zymogram of MMP-9 level in human pulp fibroblasts表2 人牙髓成纤维细胞中MMP-9水平的明胶酶谱IOD值 （n=20，×103，±s）
**P<0.01
组别对照组实验组t第2天15.42±1.63 18.26±1.80 5.230**第4天15.53±1.71 18.67±1.35 6.448**第6天15.47±1.59 22.34±1.51 14.020**第8天15.65±1.77 23.17±1.53 14.379**第10天15.63±1.34 23.88±1.62 17.553**
欲对MMP-9在牙髓炎症中的作用机制及途径进行深入探讨，则需通过体外的细胞学实验来完成。本研究即从MMPs酶原合成阶段最主要的调节因素细胞因子入手，检验牙髓炎中最重要的介质IL-1对体外培养的人牙髓成纤维细胞中MMP-9表达的影响，并对其在体外细胞系中的表达定位情况进行观察。
本研究采用SP法检测体外培养的人牙髓成纤维细胞中MMP-9的表达，结果显示对照组人牙髓成纤维细胞中，大部分样本MMP-9的表达呈阴性，仅少数样本中可见散在的免疫组化染色阳性颗粒，证实在生理状态下MMP-9的表达量极少，可能仅以酶原形式少量存在于细胞胞浆中。而经IL-1β刺激后的实验组人牙髓成纤维细胞中MMP-9的表达显着增高，染色阳性颗粒主要分布于细胞胞浆中，少量分布于细胞外基质中，这符合MMPs作为胞外酶的生物学特性，它主要在细胞内合成并分泌至细胞外发挥作用，而IL-1β能够使人牙髓成纤维细胞合成和分泌至细胞外的MMP-9的量增多，这与其他学者的研究结果相符[6]。
明胶酶谱法是测定明胶酶（MMP-2、-9）表达和活性常用的方法，其专一性强、操作简便、适用范围广，被广泛用于MMPs的活性测定。本实验中其作为免疫组化定性分析的进一步补充。结果显示，对照组人牙髓成纤维细胞中，MMP-9的表达量较低，条带模糊不清，随培养时间的变化不明显，实验组与对照组MMP-9表达水平的差异虽然具有统计学意义，但IOD值相差并不悬殊，表明MMP-9在牙髓成纤维细胞中的表达总量较低。加之MMP-9缺乏降解Ⅰ型和Ⅲ型胶原的能力，故可以认为MMP-9在牙髓炎症基质降解中可能仅起辅助作用。
明胶酶是以酶原形式分泌的，其活性中心位于催化结构域，在某些激活剂的作用下，前肽区水解或变构，使酶的活性中心暴露，从而使MMPs激活，只有活化后的MMPs才具有降解基质蛋白的功能[7]。本实验明胶酶谱分析仅检测到MMP-9酶原形式，推测其原因可能是由于样本中活性酶的含量较少，不易检测到。这提示IL-1β可能仅调节MMPs的合成和分泌，并未参与MMPs的激活，但这还缺乏有力证据。近年来的研究显示，IL-1β对MMPs的作用可能是通过刺激原癌基因产物C-Fos的表达来实现的，C-Fos作为转化激活因子与MMPs基因的启动区活化蛋白-1（Activator Protein-1，AP-1）结合位点相结合，促进其基因转录[8]，进而促进人牙髓成纤维细胞中MMPs的合成和分泌。其中的具体作用机制仍有待进一步研究。
Figure 1 Expression of MMP-9 in control group(by inverted phase contrast microscope×200)图1 对照组MMP-9的表达（倒置相差显微镜×200）
Figure 2 Expression of MMP-9 in experimental group(by inverted phase contrast microscope×200)图2 实验组MMP-9的表达（倒置相差显微镜×200）
Figure 3 Gelatin zymogram of control group图3 对照组明胶酶谱
Figure 4 Gelatin zymogram of experimental group图4 实验组明胶酶谱
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