陈以胜 李晓红 张 赛
综述
基于生物力学的干细胞调控及相关物理性质的测定
陈以胜 李晓红 张 赛△
干细胞移植对许多疾病有治疗作用，但移植部位微环境的改变会影响干细胞的生长、迁移及分化等一系列进程。目前对化学微环境如缺氧、神经生长因子、某些离子等的研究较为深入，并形成了相应的针对临床的治疗措施，但对移植相关的物理微环境知之甚少，对损伤相关的机械力、基质弹性和硬度等力学因素的调控及检测有待进一步研究。本文就力学微环境对干细胞的影响以及相关物理指标的测定方法进行综述。
干细胞；细胞外基质；力学信号转导；原子力显微镜
干细胞巢指干细胞所处的局部微环境构成，一般包括干细胞的相邻细胞、黏附分子及基质等，可以将它定义为一种结构与功能的综合体，维持着局部组织的稳态、促进损伤后组织的修复与再生[1]。干细胞巢通过不同信号途径调控着干细胞的行为，维持着细胞之间信息交换、细胞与基质的黏附以及各种生物化学信号传递等一系列过程，使干细胞的自我更新和分化处于平衡状态[2]。即使没有生物化学因素的参与，基质的硬度、细胞表面的形貌以及细胞所受的外力等力学因素也能调控干细胞的生长、迁移及分化[3]。
1 细胞外基质（extracellular matrix，ECM）与干细胞力学微环境的关系
ECM是组织的重要成分，主要由胶原、糖蛋白、蛋白聚糖等构成，为一种含水胶状物，它由细胞本身所分泌，为细胞生长、黏附、增殖、分化、形态及基因表达提供力学支撑[4]。ECM对细胞功能及分化方式具有调节作用，并为体外培养的干细胞提供微环境，因此在组织工程学上可以此为基础制作二维或三维培养基对干细胞进行培养[5]。
ECM对干细胞的力学微环境具有调节作用，而力学微环境的改变也会反过来影响ECM。Mauch等[6]率先研究力学微环境对ECM成分表达的影响，他们将细胞分别置于坚硬的二维培养基质和弹性相对较大的三维胶原凝胶中培养，并比较ECM的组成成分及相关调节酶的表达，研究发现，弹性较大的三维培养基比硬度较大的二维培养基中成纤维细胞的胶原表达量明显降低；在三维胶原支架中培养的细胞，其表达α1（Ⅰ）、α2（Ⅰ）和α1（Ⅲ）型胶原蛋白的mRNA水平均降低；而在硬度较小的三维胶原支架中培养的细胞，其胶原蛋白酶活性大大增强。基质的硬度不仅影响ECM成分，还会影响与这些成分沉淀及相互结合有关的其他参数[7]。由此可见，细胞所处的力学微环境可调节细胞本身对ECM成分的分泌，而ECM成分的改变反过来影响细胞所处微环境的力学性质，比如硬度或弹性。正常生理情况下，人体细胞与其所处的在体环境之间保持着一种力学稳态，因此细胞可维持正常的性质和功能。同样，干细胞的存活、增殖和分化也需要特定的生长环境，在一定程度上可以对这种力学环境进行干预，以促进干细胞的增殖并引导其向不同方向分化[8]。
人间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的形态及分化方式对生存环境极其敏感。首先，基质的硬度能控制MSCs的命运，Engler等[9]通过模拟在不同硬度的培养基中培养离体MSCs，观察各种条件下细胞的分化，发现MSCs培养基弹性越接近大脑组织的弹性（0.1～1 kPa），多数能向神经细胞分化，随着基质硬度的增加，则更多向脂肪组织或骨组织进行分化，该研究指出，虽然基质弹性不是干细胞分化的最终决定因素，但对其过渡到早期的发展谱系具有一定引导作用。其次，细胞形态会影响干细胞。McBeath等[10]通过应用微缩成像技术调控细胞的形状和细胞变形（摊开）的程度，然后在二维环境下进行培养，发现MSCs在接触变形（摊开）的情况下大多分化为骨细胞，而在无形态变化的圆形情况下多数分化为脂肪细胞，其又发现RhoA是在自然条件下调控细胞形状的因子，进而证实了细胞形态、细胞骨架及RhoA信号共同调节MSCs的分化。而之后有研究在三维培养条件下进行了类似的研究，得出与此相悖的结论[11]。有研究发现应用电子束曝光技术描述细胞表面形貌图时，相关形貌图的改变也会影响干细胞的分化[12]。此外，某些机械力也通过调节干细胞转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）或钙调蛋白等基因的表达，进而影响干细胞的分化命运[13]。
2 模拟干细胞在体生长环境
对干细胞的培养及研究通常是在一种模拟人体组织环境的二维培养基或三维培养基进行。前者在过去应用比较多，比如在不同弹性模量的聚丙烯酰胺水凝胶上培养细胞，以明确其生长及分化情况。Robert等[14]较早对这一培养方法进行试验，并通过宏观力学方法测定水凝胶的弹性模量。随后Engler等[15]不断改进这一方法，并从宏观的弹性拉伸仪和微观的原子力显微镜两个角度对弹性模量进行描述，较之前更为精确。由于通过单丙烯酰胺和双丙烯酰胺的不同浓度配比可以合成不同弹性模量的聚丙烯酰胺水凝胶，因此这一材料在研究生物力学对干细胞的影响方面应用比较普遍。
二维培养环境中生长的细胞因受到单纯牵张力或压缩力的影响，不能模拟真实的人体组织环境，因此在研究机械力学对细胞的影响及相关的力学信号转导机制方面受到一定限制。目前有许多研究应用三维支架针对干细胞进行培养，并通过调节力学载荷和基质硬度来观察细胞的生长情况，已经取得较好的效果，证明了三维支架在体外培养细胞方面的优势[11]。三维培养环境中培养基的力学性质可随细胞的生长变化而改变，同时细胞也能感受ECM的硬度变化并作出相应的反应，如生长状态、形态、迁移和分化等均可能发生改变。有研究发现，随着三维微环境硬度的变化，MSCs的分化方式也发生相应改变，比如在弹性模量为11～30 kPa的培养基中，MSCs大部分向成骨细胞分化，在弹性模量为2.5～5.0 kPa的培养基中则多向脂肪细胞分化，而在更软的培养条件下，可能向神经元进行分化。相比之前的应用二维培养基质所进行的细胞研究，细胞的命运与其形态并不相关，基质的硬度通过调节整合素的结合以及黏附配体的重新组合而发生变化[16]。然而，ECM在三维微环境下具体对干细胞起到怎样的作用及其潜在的生物物理机制仍需要进一步探讨。
聚乙烯醇、明胶、壳聚糖等都曾用于干细胞的三维培养，壳聚糖及其衍生物制备的海绵支架对细胞迁移和神经轴突再生有重要作用，其相容性好，物理性状接近脑组织，力学特性和损伤组织相似，具有一定的黏弹性和抗压性能[17]，易使细胞在其表面附着生长，因此在神经组织工程领域具有较广阔的应用前景[18]，在研究颅脑创伤（traumatic brain injury，TBI）后干细胞脑内原位移植方面也具有重要意义。
3 干细胞力学信号转导机制
细胞与ECM之间的相互作用是真核细胞生物学的核心[19]，因此，操控着细胞生长命运的实质上是以物质体系为基础的细胞与胞外物质的相互作用，尤其是自然条件下ECM中包含的整合素结合配体[20]。不论细胞受到何种机械力（如牵张力、剪切力或压缩力等）作用，其力学信号转导的分子机制类似，三维基质中力学感受蛋白及黏附结构的转变是完成信号转导过程的基础[21]。细胞表面的整合素和ECM中的一系列相关蛋白是细胞黏附复合物的重要组成成分，整合素是由1条a链和1条b链组成的二聚体，充当ECM中某些成分的受体，这两条链的结合方式有20余种，不同的结合物作为特定ECM配体的受体参与力学信号转导途径中。以整合素为基础的黏附复合物是一种复杂的动态结构，它是信息从ECM传递到细胞所必需的[22]。当整合素与配体结合后，一方面导致细胞骨架重排、微丝蛋白构象改变，最终与染色体接触引起细胞功能改变；另一方面激活FAK，FAK磷酸化后激活其下游信号转导途径，如Ras∕MAPK途径，继而活化转录因子和AP-1家族，导致细胞增殖的改变[23]。由于整合素缺乏酶的活性，它只能在ECM和细胞骨架上的肌动蛋白或其他信号蛋白之间起物理连接作用，如此便形成ECM-整合素-细胞骨架这个连接模式[24]，除了上述基本结构，还有许多信号分子也参与到力学信号转导途径中，比如FAK、JNK、Ca2+和最近研究发现的YAP和TAZ等[23]。激活细胞膜力敏感离子通道使细胞内Ca2+浓度升高，可导致细胞明显增殖，由于Ca2+是力信号转导途径中重要的第二信使，研究人员由此认为Ca2+动员增强是导致细胞增殖增强的一个重要因素[25]。触动G蛋白偶联的酪氨酸激酶磷酸化与MAPKs调节的级联反应也被认为是机械载荷刺激干细胞后的一个信号的转导通路[26]。当然，虽然存在着多条不同的信号转导通路，但它们之间是密切联系的，这表明在感受应力刺激的过程中需要的是整个细胞的参与，而不可能只依赖于单一的信号转导通路。
4 对细胞表面形貌、微观力学及组织弹性的测定
原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）可实时测量生理状态生物样品分子间作用力的动态变化，如化学基团间的作用力、受配体作用、DNA互补链和核苷碱基间的氢键、运动蛋白质间的相互作用等，进而综合研究生理环境中的各种生物样品的微观性质[27]。它具有高分辨率，对振幅及方向的精确控制，对细胞和组织损伤小，能描述细胞表面的形态并与细胞发生相互作用等特点，是唯一能让研究人员获得高清的细胞表面形貌数据、控制细胞所受的作用力、测量细胞弹性并调控存活细胞弹性模量的工具，主要分接触式与敲击式两种模式[28]，后者在细胞研究中更常用。
当原子力显微镜悬臂梁上的针尖靠近细胞或基质表面进行水平扫描成像时，针尖随着表面的起伏而改变高度，从而得到细胞或培养基质的表面形貌图像[29]，在研究细胞形态学上具有很大优势。如果将针尖相对样品在竖直方向来回运动，在力谱测量过程中系统通过一系列转化可绘得力-距离曲线[30]，既可以得到牵引力、表面张力等微观力学指标，又可间接得到弹性模量值。它已被广泛用于测量存活神经元以及脑组织切片的弹性模量，根据不同测量目的，选择不同AFM的针尖。若要测得组织团块的弹性模量，一般选用圆头的针尖；若要测量细胞表面定点作用力或细胞的弹性模量，则应选择锥型针尖[31]。
除了原子力显微镜外，弹力试验机也可测量物体的弹性模量，但该仪器主要是从宏观角度针对形状规则的材料进行测量，通过对材料进行拉伸或压缩，根据施加的力及相应的材料应变程度，电脑绘制出相应曲线图，进一步获得弹性模量值，材料的厚度也可同时得出[32]。
5 展望
细胞生物力学目前倍受关注，在各种内外机械因素影响下，尤其是在外伤性疾病中信息通过力学信号转导作用于人体细胞，导致细胞发生一系列的病理生理变化，最终影响细胞的生长、增殖、分化。颅脑创伤不仅会引起神经细胞损害和神经系统功能障碍，而且通常伴随脑水肿、颅内高压及脑组织弹性变化，治疗比较棘手。亚低温联合温敏干细胞移植对促进TBI后神经功能恢复作用在之前研究中已得到证实[33]，这种联合治疗方式不仅能保证较高的移植干细胞存活率，而且增加了干细胞的增殖和向神经元分化的能力。由于亚低温可降低脑组织代谢率，在一定程度上可能改善颅脑创伤后缺氧所致的脑水肿，笔者据此推断亚低温通过改善脑组织的力学微环境，进一步调节移植干细胞的增殖、凋亡和分化情况，这可能是干细胞移植的一种力学机制。在之前的研究基础上，可以通过测定相关物理指标对该力学微环境进行评估，壳聚糖及凝胶等生物材料的研发，也为体外模拟细胞在体环境提供技术支撑，为下一步干细胞的三维培养和力学信号转导途径及其相应治疗措施的研究奠定基础。
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（2014-04-23收稿 2014-05-15修回）
（本文编辑 闫娟）
Regulation of Stem Cells Based on the Biomechanics and Measurement of their Associated Physical Properties
CHEN Yisheng,LI Xiaohong,ZHANG Sai△
Institute of Traumatic Brain Injury and Neuroscience of CAPF，The Affiliated Hospital of The Logistics University of CAPF，Tianjin 300162,China.
△
E-mail:zhangsai718@yahoo.com
Stem cells transplantation had been proved to be effective in many clinical diseases.However,microenvironment can influence their growth,migration and differentiation.Under chemical microenvironment,such as hypoxia,neural growing factors and different kinds of ions,stem cells had been intensively studied while little is known about their performance under physical microenvironment.The effects of mechanical forces,elasticity and rigidity of the matrix of stem cells are still to be further investigated.This article is to summarize how microenvironment controls the fate of stem cells and to review the measurement of the mechanical properties.
stem cells;extracellular matrix;mechanotransduction;atomic force microscope
R318
A
10.3969∕j.issn.0253-9896.2014.10.023
国家自然科学基金项目（81271392，81301050）
武警部队脑创伤与神经疾病研究所，武警后勤学院附属医院（邮编300162）
△通讯作者 E-mail：zhangsai718@yahoo.com
