马明坤，闫卫利，魏葆琳，蒋志云，李桐，温学红△
清热合剂对上呼吸道感染常见致病菌的体外抑菌试验
马明坤1，闫卫利1，魏葆琳2，蒋志云1，李桐1，温学红1△
目的观察清热合剂对上呼吸道感染常见致病菌的体外抑菌活性。方法上呼吸道感染常见致病菌163株中不产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性菌74株（大肠埃希菌33株，肺炎克雷伯菌24株，铜绿假单胞菌17株）；产ESBLs革兰阴性菌10株（大肠埃希菌6株，肺炎克雷伯菌4株）；革兰阳性菌79株[耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）11株、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）46株，肺炎链球菌22株]。采用琼脂稀释法对清热合剂进行定量抑菌试验，配制含有不同药物浓度的琼脂平板，在平板上接种待测菌株菌悬液，孵育后观察含药平板，记录最低抑菌浓度（MIC）。结果清热合剂对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌等革兰阴性菌的MIC90分别为88、176、22 g/L，其对产ESBLs与不产ESBLs革兰阴性菌的抑菌效果一致；不同浓度药物对铜绿假单胞菌的累积抑菌率均最高。清热合剂对MSSA、MRSA和肺炎链球菌等革兰阳性菌的MIC90分别为11、11、22 g/L，MRSA的MIC90与MSSA相同，但MIC50略高于MSSA；不同浓度药物对MSSA和MRSA的累积抑菌率均高于肺炎链球菌，对MSSA与MRSA的累积抑菌率相近。结论清热合剂对上呼吸道感染常见的致病菌除肺炎克雷伯菌之外均有一定的抑菌作用，对革兰阳性菌的抑菌效果明显优于革兰阴性菌。
呼吸道感染；微生物敏感性试验；革兰阴性菌；革兰阳性菌；致病菌；琼脂稀释法；清热合剂
上呼吸道感染（upper respiratory tract infection, URTI）是临床上常见的感染性疾病，是鼻腔、咽或喉部急性炎症的概称[1]，多由病毒引起，细菌感染常继发于病毒感染。中医药治疗URTI的效果在临床上得到了肯定。目前，针对金黄色葡萄球菌的中药体外试验的研究较多，很多中药单体如黄连、大黄等对其均有不同程度的抑菌作用[2-3]。但是专门针对URTI常见致病菌的中药抑菌试验的相关研究仍较少，尤其是中药复合制剂体对上呼吸道感染的体外抑菌试验尚少见报道。本研究采用的清热合剂是由金银花、连翘、钩藤等组成的复合制剂，主要研究清热合剂对URTI的多种致病菌的体外抑菌作用，并对抑菌效果进行了横向比较分析，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要材料（1）菌株。2012年11月—2013年4月我院检验科细菌室分离的痰或咽拭子标本中的细菌共163株，其中不产超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-actamases,ESBLs）革兰阴性菌74株（大肠埃希菌33株，肺炎克雷伯菌24株，铜绿假单胞菌17株）；产ESBLs革兰阴性菌10株（大肠埃希菌6株，肺炎克雷伯菌4株）；革兰阳性菌79株[耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）11株、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（methicillin-sensitive Staphylococcus aureus,MSSA）46株，肺炎链球菌22株]。细菌鉴定采用法国生物梅里埃公司VITEK 2 compact全自动细菌鉴定及药敏分析仪。（2）中药。清热合剂是由我院药剂科制备的全成分配方颗粒，符合《天津市中药配方颗粒质量标准（暂行）》。主要成分：金银花、连翘、钩藤、黄芩、板蓝根、桔梗、前胡、生甘草、广藿香、荆芥等14味中药。每袋6.25 g，溶于9 mL生理盐水，漩涡混匀器混匀，121℃高压灭菌20 min备用。（3）培养基。M-H琼脂购自法国生物梅里埃公司。（4）质控菌种。本实验室标准菌株ATCC25922、ATCC25923购自天津市临检中心。
1.2 方法采用琼脂稀释法进行定量抑菌试验。
1.2.1 含药平板制备按照M-H琼脂说明书配制琼脂，121℃高压灭菌20 min，冷却至50℃左右时在超净工作台中平板振荡器上加入中药溶液，针对革兰阴性菌配制成终浓度为176.00、88.00、44.00、22.00、11.00、5.50 g/L的M-H琼脂平板，针对革兰阳性菌配制成22.00、11.00、5.50、2.75、1.38、0.69 g/L的M-H琼脂平板。链球菌抑菌试验需在高压后的M-H琼脂冷却至50℃左右时，先加入5%（V/V）绵羊血，再按不同浓度加入中药液，制成含药血M-H平板。同时设不接种菌液的平板作为无菌对照，在不含中药的M-H平板接种质控菌株菌液作为生长对照。
1.2.2 菌悬液制备将163株待测菌株制成0.5麦氏浊度的菌悬液，再按1∶10稀释后接种1 μL于琼脂平板表面，每点菌量约为1×104CFU。
1.2.3 培养与观察接种后的平板置于35℃孵育箱中，接种链球菌的平板置于5%CO2培养箱中孵育16～20 h。若无菌对照不生长，生长对照有菌落生长则试验有效，进而观察含药平板，确定最低抑菌浓度（MIC）。
2 结果
2.1 清热合剂对革兰阴性菌的抑菌作用清热合剂对革兰阴性菌的MIC90由低到高依次是铜绿假单胞菌＜大肠埃希菌＜肺炎克雷伯菌。清热合剂对产ESBLs与不产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的抑菌效果一致，见表1。
Tab.1The antimicrobial effect of the compound preparation on 84 strains of Gram-negative bacteria表1 清热合剂对84株革兰阴性菌的抑菌作用（g/L）
2.2 清热合剂对革兰阳性菌的抑菌作用清热合剂对MSSA、MRSA和肺炎链球菌的MIC90均低于革兰阴性菌。MRSA的MIC90与MSSA相同，但MIC50略高于MSSA，见表2。
Tab.2The antimicrobial effect of the compound preparation on 79 Gram-positive bacteria in vitro表2 清热合剂对79株革兰阳性菌的抑菌作用（g/L）
2.3 清热合剂对革兰阴性菌的累积抑菌率各个不同浓度的清热合剂对铜绿假单胞菌的累积抑菌率均最高。其次是大肠埃希菌，对肺炎克雷伯菌的累积抑菌率最低，见表3。
2.4 清热合剂对革兰阳性菌的累积抑菌率各个不同浓度的清热合剂对MSSA和MRSA的累积抑菌率均高于肺炎链球菌，不同浓度的清热合剂对MSSA与MRSA的累积抑菌率相近，见表4。
3 讨论
上呼吸道感染属于中医学外感风热，温病范畴，为温病初起,风热表证,邪在卫分,邪正相争。游思湘等[4]研究显示复方黄连注射剂对耐药性金黄色葡萄球菌具有明显体外抑菌和耐药抑制作用，其MIC为7.8 g/L。孙涛等[5]研究表明川贝母止嗽颗粒可不同程度地对革兰阳性、革兰阴性临床分离菌株发挥体外抑菌作用。我院的复方制剂清热合剂是由14味中药制成的，以银翘散为基础加减,方中金银花、连翘清热解毒，轻宣透表，为主药；荆芥、薄荷辛散表邪，透热外出，为辅药；黄芩、板蓝根、桔梗、前胡等合用，清热解毒，利咽散结，宣肺祛痰；藿香、厚朴芳香辟秽，行气化湿，疏利气机；拳参、钩藤清热镇惊熄风；甘草调和诸药。全方共奏疏散风热，清热解毒，芳香化湿，镇惊熄风之功。14味中药对于风热感冒，温病初起之症均有一定效果。
Tab.3The accumulated antibacterial rate of the compound preparation on 84 Gram-negative bacteria in vitro表3 清热合剂对84株革兰阴性菌的累积抑菌率
Tab.4The accumulated antibacterial rate of the compound preparation on 79 Gram-positive bacteria in vitro表4 清热合剂对79株革兰阳性菌的累积抑菌率
本研究结果显示，清热合剂对铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌3种革兰阴性菌的MIC90依次升高，其对铜绿假单胞菌的抑菌效果最好。另外，各个不同浓度的清热合剂对铜绿假单胞菌的累积抑菌率也最高，其次是大肠埃希菌，对肺炎克雷伯菌抑菌效果最差。清热合剂对产ESBLs革兰阴性菌与不产ESBLs革兰阴性菌的抑菌效果相近，与刘东梅等[6]研究结果一致，提示中药的抑菌作用原理与化学抗菌药物不同，与细菌是否产酶无关，可能与中药对耐药菌株的质粒消除作用有关[7]。但本研究中清热合剂对产ESBLs和不产ESBLs两种大肠埃希菌的MIC均低于秦静英等[8]的研究结果，原因可能是后者使用的为单方黄芩苷，本研究的制剂为复合制剂，其他成分的存在增强了黄芩的抑菌作用。另外，本研究中清热合剂对MSSA、MRSA和肺炎链球菌等革兰阳性菌的抑菌效果明显优于革兰阴性菌，MSSA、MRSA的累积抑菌率均高于肺炎链球菌。MRSA的MIC90值与MSSA相同，但MIC50值略高于MSSA，提示清热合剂对MRSA的抑菌效果略差于MSSA，但仍有较高的活性，这与尉景娟等[9]的研究结果一致。
综上所述，清热合剂对上呼吸道感染常见的致病菌除肺炎克雷伯菌之外均有一定的抑菌作用，研发有效的中药复合制剂将有助于临床感染疾病的治疗。但由于本文选取的标本来源于上呼吸道感染患者痰及咽拭子，分离出的产ESBLs的革兰阴性菌和MRSA数量较少，有待今后增大样本量以及对产酶菌的专项研究。
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（2013-12-16收稿2014-05-28修回）
（本文编辑陈丽洁）
In vitro antibacterial test of Chinese medicine compound preparation for common pathogenic bacteria in upper respiratory tract infection
MA Mingkun1,YAN Weili1,WEI Baolin2,JIANG Zhiyun1,LI Tong1,WEN Xuehong1△
1 Department of Clinical Laboratory,2 Department of Pulmonary Medicine，the Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300150,China△
ObjectiveTo observe the antimicrobial effect of a kind of Chinese medicine Qingre compound preparation on the common pathogenic bacteria of upper respiratory tract infection(URTI).MethodsA total of 163 common pathogenic bacteria of URTI was selected in this study,including 74 non extended-spectrum β-lactamases(ESBLs)-producing Gram-negative bacteria(33 Escherichia coli,24 Klebsiella pneumonia and 17 Pseudomonas aeruginosa),10 ESBLs-producing Gram-negative bacteria(6 Escherichia coli and 4 Klebsiella pneumoniae)and 79 Gram-positive bacteria[11 methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA),46 methicillin-sensitive Staphylococcus aureus and 22 Streptococcus pneumoniae].Agar dilution method was adopted to perform the quantitative drug sensibility test.Agar plates that contained different concentrations of Qingre compound preparation were prepared.The bacterial suspension was planted on the plates.Then we observed the plates after incubation,and recorded the minimum inhibitory concentration(MIC).ResultsThe antimicrobial rates of Qingre compound preparation were 88,176 and 22 g/L for MIC90 of Escherichia coli,Klebsiella pneumoniae, and Pseudomonas aeruginosa.The antimicrobial effects of Qingre compound preparation were coincident on the MIC90 of ESBLs-producing strains and non ESBLs-producing strains.The accumulated antibacterial rates of different concentrations of medicine to Pseudomonas aeruginosa were the highest.The MIC90 values of Qingre compound preparation were 11,11 and 22 g/L for MSSA,MRSA and Streptococcus pneumoniae.The MIC90 of MRSA was coincident with MSSA,but MIC50 of MRSA was slightly higher than that of MSSA.The accumulated antibacterial rates of different concentrations of medicine to MSSA and MRSA were all higher than those of Streptococcus pneumonia.The accumulated antibacterial rate of MSSA wassimilar with that of MRSA.ConclusionThe Chinese medicine Qingre compound preparation could restrain common pathogenic bacteria of URTI except Klebsiella pneumoniae.The antibacterial effect of Qingre compound preparation is significantly better in Ggram-positive bacteria than that of Gram-negative bacteria.
respiratory tract infections;microbial sensitivity tests;Gram-negative bacteria;Gram-positive bacteria; pathogenic bacteria;agar dilution method;qingre compound preparation
R285.5
A
10.3969/j.issn.0253-9896.2015.01.010
国家自然科学基金面上项目（81373849）
1天津中医药大学第二附属医院检验科（邮编300150）；2肺病科
马明坤（1979），女，主管技师，学士，主要从事临床免疫及微生物学检验研究
△通讯作者E-mail：13662199693@163.com
