贾林，林智峰，马莉，唐玉玲，杨锐，杨晓萍
P38MAPK抑制剂SB203580对高糖诱导HK-2细胞转分化的影响
贾林，林智峰，马莉，唐玉玲，杨锐，杨晓萍
摘要：目的探讨不同浓度P38丝裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）抑制剂SB203580在高糖诱导肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化（TEMT）过程中的机制及其较佳作用浓度。方法体外培养人近端肾小管上皮细胞（HK-2）并分为对照组（5.5 mmol/L GS）、DMSO组（5.5 mmol/L GS+30 μmol/L SB203580等体积的DMSO）、高糖组（30 mmol/L GS），以及30 mmol/L GS+5、10、20、30 μmol/LSB203580处理的S5、S10、S20及S30组，干预48 h。四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖情况，计算半数抑制浓度（IC50）；选取对照组、高糖组、S30组，Western blot法检测P38MAPK、P-P38MAPK及α-平滑肌肌动蛋白（SMA）的表达、免疫荧光法检测α-SMA的表达。结果 （1）与对照组相比，DMSO对HK-2细胞增殖无显着抑制作用（P＞0.05）；高糖组、S5组HK-2细胞增殖增多（P＜0.05）；S20、S30 组HK-2细胞增殖减少（P＜0.05）。与高糖组相比，S5、S10、S20、S30组细胞增殖均受到抑制（P＜0.05）。（2）与对照组相比，高糖组、S30组P-P38MAPK表达量增高（P＜0.05）。与高糖组相比，S30组P-P38MAPK的表达量降低（P＜0.05）。3组P38MAPK表达量无显着差异（P＞0.05）。（3）与对照组相比，高糖组、S30组α-SMA表达量增高（P＜0.05）。与高糖组相比，S30组α-SMA表达量降低（P＜0.05）。结论30 mmol/L GS可以诱导HK-2细胞TEMT；30 μmol/L SB203580是抑制HK-2细胞TEMT的较佳抑制浓度，SB203580可能通过下调P-P38MAPK表达，从而抑制HK-2细胞增殖及胞浆中α-SMA的表达，延缓TEMT进程。
关键词：糖尿病肾病；肾小管；上皮细胞；上皮间质转分化；P38丝裂原活化蛋白激酶；SB203580
糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病引发的微血管病变之一，与氧化应激、细胞因子表达异常等多种因素有关，可表现为炎症介质浸润、肾小球硬化和肾间质纤维化［1-2］。其中，肾间质纤维化的主要病理特点是成纤维细胞及肌成纤维细胞（myofibroblast，MyoF）异常增生，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）分泌过多，超过自身清除能力，导致ECM在肾间质内过度沉积。α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）是MyoF出现及肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化（TEMT）开始的标志。新生MyoF 30%以上来源于TEMT［3］。因此，TEMT在DN病程发展中可能起着重要的作用。研究发现，P38丝裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）信号通路活化可加速TEMT的进程［4］。SB203580是P38MAPK的抑制剂，已广泛应用于TEMT的研究中，但它的作用浓度及抑制效果尚少见相关报道。本研究旨在探讨SB203580在30 mmol/L葡萄糖（Glucose，GS）诱导TEMT过程中的较佳作用浓度及其可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1主要仪器和试剂xMark酶联免疫检测仪、XR+凝胶成像仪（BIO-RAD公司）、显微镜（OLYMPUS公司）、LSM 510 META共聚焦显微镜（ZEISS公司）。人近端肾小管上皮（HK-2）细胞（上海通派公司）、胎牛血清（FBS，BI公司）、DMEM（无糖）/F12培养基（Gibicol公司）、0.25%胰蛋白酶+ EDTA（Heclon公司）、SB203580（Calbiochem公司）、MTT（Solarbio公司）、二甲基亚砜（DMSO，上海前尘生物科技有限公司）、鼠抗人α-SMA抗体（博士德公司/abcam公司）、兔抗人P38MAPK抗体、兔抗人P-P38MAPK抗体（Cell Signaling公司）、多聚甲醛（博士德生物公司）、山羊血清（中杉金桥公司）。
1.2方法
1.2.1细胞培养及分组体外培养HK-2细胞，复苏后用含10%FBS的DMEM（无糖）/F12培养液于5%CO2、37℃培养箱中培养，当细胞融合度达75%～80%时，用0.25%胰蛋白酶+ EDTA消化，传代培养，取第2～7代细胞用于实验。HK-2依处理方式的不同分为7组：对照组（5.5 mmol/L GS）、DMSO组（5.5 mmol/L GS+30 μmol/L SB203580等体积的DMSO）、高糖组（30 mmol/L GS）、S5组（30 mmol/L GS+5 μmol/L SB203580）、S10组（30 mmol/L GS+10 μmol/L SB203580）、S20组（30 mmol/L GS+20 μmol/L SB203580）、S30组（30 mmol/L GS+30 μmol/L SB203580），干预48 h。倒置相差显微镜下观察各组细胞形态。
1.2.2MTT法检测HK-2细胞增殖收集对数生长期HK-2细胞并接种于96孔板内，每孔加入100 μL细胞悬液，将待测细胞密度调至2 000个/孔，边缘孔用无菌PBS填充；次日，待细胞贴壁后吸出培养基，PBS洗1次后，加入DMEM/F12同步化12 h，按1.2.1分组并加入不同浓度SB203580，每组9个复孔；48 h后PBS洗1次，每孔加入100 μL完全培养基及20 μL 5 g/L MTT溶液，设置空白调零孔（只加完全培养基及MTT），避光孵育4 h后，小心吸去孔内培养液；每孔加入150 μL二甲基亚砜，酶标仪中低速振荡3次，每次3 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔光密度（OD）值；实验重复3次，计算抑制率（IR）=［OD高糖组-ODSB203580组］/ OD高糖组×100%，计算半数抑制浓度（IC50）［5］。
1.2.3Western blot检测 HK-2细胞中 P38MAPK、PP38MAPK、α-SMA的表达设对照组、高糖组及S30组。取对数期细胞种板，按上述分组加药，干预48 h后冰上裂解并收集细胞，4℃12 000 r/min离心25 min，提取蛋白，BCA试剂盒测蛋白浓度，配平后加入 5×loading buffer，混匀后100℃8 min煮沸，使蛋白变性，上样电泳，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜转膜，5%脱脂奶粉或BSA室温封闭2 h，兔抗人单克隆P38MAPK、P-P38MAPK抗体（1∶1 000）或鼠抗人单克隆α-SMA抗体（1∶500）、β-actin抗体（1∶1 000）4℃孵育过夜，二抗（1∶20 000）室温孵育2 h，暗室曝光，凝胶成像和Gel-Pro analyzer分析系统进行灰度分析。
1.2.4免疫荧光法检测HK-2细胞中α-SMA的表达设置对照组、高糖组及S30组。取对数期细胞，每孔加入100 μL细胞悬液，接种于置有无菌玻片的6孔板中爬片，细胞数约8 000个/张，按上述分组加药干预48 h。PBS洗3次后用4%多聚甲醛固定15 min，10%山羊血清室温封闭30 min，滴加鼠抗人单克隆α-SMA抗体（1∶50），4℃孵育过夜，FITC标记抗小鼠IgG（1∶100）室温孵育1.5 h，于蓝色激发光（绿光）下观察荧光强度。
1.3统计学方法采用SPSS 17.0统计软件处理。符合正态分布的计量资料以x±s表示，多组间比较用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1HK-2细胞形态学观察对照组HK-2细胞呈鹅卵石状，细胞呈现卵圆形、多边形，胞核居中，呈岛屿状、簇状生长，细胞间连接紧密；DMSO组较对照组无显着差异；高糖组细胞逐渐向长椭圆形、长梭形转变，生长较前松散；加入SB203580处理48 h后，细胞生长较前缓慢，胞体略增大，胞浆中可见凋亡小体，且随着SB203580浓度上升，胞浆中凋亡小体数量呈现递增趋势，见图1。
2.2HK-2细胞增殖结果比较与对照组相比，DMSO组、S10组HK-2细胞增殖不明显（P＞0.05）；高糖组、S5组HK-2细胞增殖明显（P＜0.05）；S20、S30组HK-2细胞增殖显着被抑制（P＜0.05）。与高糖组相比，S5、S10、S20、S30组OD值均下降（P＜0.05），细胞数目明显减少，见表1。SB203580 IC50为29～36 μmol/L。
Tab.1 Comparison of OD value and inhibitory rate of HK-2 cells between seven groups表1 各组HK-2细胞OD值及抑制率比较 （n=9，x±s）
2.3HK-2细胞中P38MAPK、P-P38MAPK表达对照组、高糖组、S30组P38MAPK/β-actin灰度值比值分别为0.900±0.182、0.909±0.121及0.921±0.173（F=1.638，P＞0.05）。P-P38MAPK/β-actin分别为0.123±0.066、0.629±0.193及0.235±0.095（F=1 057.744，P＜0.05），其中，与对照组相比，高糖组、S30组P-P38MAPK条带变粗变深，P-P38MAPK蛋白表达增多；与高糖组相比，S30组P-P38MAPK蛋白表达量降低，见图2。
Fig.2 Expressions of P38MAPK and P-P38MAPK of HK-2 cells detected by Western blot assay图2 Western blot法检测各组HK-2中细胞P38MAPK、P-P38MAPK的表达
2.4HK-2细胞α-SMA表达结果比较对照组、高糖组、S30组α-SMA荧光强度分别为11.314±0.732、63.914±3.691及 23.082±2.123（F=612.424，P＜0.05），其中高糖组、S30组较对照组增强；与高糖组相比，S30组荧光强度减弱（P＜0.05）。Western blot结果示α-SMA表达量分别为0.091±0.013、0.334± 0.033及0.167±0.078（F=106.718，P＜0.05），其趋势与免疫荧光法结果基本一致，见图3、4。
Fig.3 The expression of α-SMA of HK-2 cells in three groups图3 SB203580干预48 h后各组HK-2细胞中α-SMA的表达（×630）
Fig.4 The expression of α-SMA of HK-2 cells detected by Western blot assay图4 Western blot法检测各组HK-2细胞α-SMA的表达
3 讨论
肾小管上皮细胞是一种稳定细胞，生理情况下增殖不明显，只有在受到损伤等刺激时，才表现出较强的再生能力。在DN病程发展过程中，肾小管上皮细胞在高糖刺激下出现TEMT，其特征为肾小管上皮细胞原有表型特征丧失，出现MyoF表型［4］。同时，研究还发现，α-SMA表达量与TEMT严重程度密切相关［6］。本研究MTT结果显示，高糖组HK-2细胞增殖率高于对照组；同时高糖组α-SMA表达量较对照组显着升高，证实了30 mmol/L GS作用48 h可以使HK-2细胞TEMT，此结果与Lyu等［7］研究一致。因此，有效抑制HK-2细胞增殖对于有效减少HK-2细胞中α-SMA的表达及TEMT至关重要。
P38MAPK是MAPKs家族成员之一，主要存在于真核细胞中，是一种高度保守的信号转导模块，具有调节细胞生长、分化、迁移及炎症等作用［8］。Huang等［9］研究表明，通过调节P38MAPK信号通路中的P-P38MAPK、转化生长因子（TGF）-β等重要信号分子，抑制P38MAPK的活化，可改善DN病程中肾脏的炎性病变。因此，P38MAPK信号通路在DN过程中发挥着重要的作用，有效抑制P38MAPK可能延缓TEMT的进程。SB203580是一类吡啶咪唑类化合物，为 P38MAPK的特异性抑制剂。SB203580可以通透细胞并抑制P38MAPK，从而抑制后续MAP激酶活化蛋白激酶（MAPKAPK）-2和MAPKAPK-3的活化，发挥生物学效应［10］。本实验结果显示，与高糖组相比，加入5、10、20、30 μmol/L 的SB203580，HK-2细胞增殖抑制率分别为6.5%、16.6%、29.8%、46.0%，证实在TEMT过程中，随着SB203580浓度逐渐增加，细胞增殖抑制率逐渐升高；而DMSO是SB203580的溶剂，具有细胞毒性，对照组和DMSO组细胞增殖差异无统计学意义，提示与30 μmol/L SB203580溶液等体积的DMSO对HK-2细胞增殖无显着抑制作用，该抑制效果与DMSO无关。同时，与高糖组相比，S30组P38MAPK表达无显着变化，P-P38MAPK表达量下降，证实SB203580可以抑制P38MAPK磷酸化，并且不改变P38MAPK总蛋白表达量，与Shi等［11］研究结果相近。
IC50常用于衡量药物诱导细胞凋亡的能力。在不同细胞种属间或同种细胞不同信号通路中，SB203580的IC50不尽相同，该差异可能与细胞种类、培养环境、细胞生长状态及药物生产厂家不同直接相关［5，12］。外源性的MTT可以使活细胞中的琥珀酸脱氢酶还原为可溶于DMSO的紫色结晶甲瓉（formazan），并沉积在细胞中，因此，可以通过测量OD值评估细胞增殖情况。本实验结果示30 μmol/L SB203580干预48 h，HK-2细胞增殖抑制率约为50%，S30组较高糖组荧光强度减弱，α-SMA表达量降低，提示30 μmol/L SB203580不仅可以有效抑制TEMT过程中P-P38MAPK的表达，同时也可使α-SMA的蛋白表达量降低，证实30 mmol/L SB203580可以抑制TEMT过程中α-SMA的表达，延缓TEMT进程。然而S30组中α-SMA表达量仍高于对照组，提示除P38MAPK信号通路外，可能尚有多条信号通路参与TEMT过程；亦可能与30 μmol/L SB203580尚不能完全阻断P38MAPK信号通路有关。
综上所述，30 mmol/L GS可以诱导HK-2细胞TEMT；30 μmol/L SB203580可以使TEMT过程中约50%HK-2细胞增殖受到抑制，是TEMT过程中的较佳抑制浓度；30 μmol/L SB203580可能通过部分下调P-P38MAPK表达，继而抑制HK-2细胞增殖及胞浆中α-SMA的表达，延缓HK-2细胞TEMT的进程。
（图1见插页）
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（2015-07-07收稿2015-10-16修回）
（本文编辑陆荣展）
The effects of P38MAPK inhibitor SB203580 on TEMT of HK-2 cells
JIA Lin，LIN Zhifeng，MA Li，TANG Yuling，YANG Rui，YANG Xiaoping
Division of Nephrology，the First Affiliated Hospital，College of Medicine，Shihezi University，Shihezi 832008，China；Corresponding AuthorE-mail:sbkyxp@163.com
Abstract：ObjectiveTo observe the effects of different concentrations of SB203580，the inhibitor of P38MAPK，in process of high glucose（GS）-induced renal tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation（TEMT）.MethodsThe cultured human renal tubular epithelial cells（HK-2）were divided into control group（5.5 mmol/L GS），GS（30 mmol/L GS）group and different concentrations of SB203580（30 mmol/L GS+5，10，20 and 30 μmol/L SB203580）groups.The treatments were for 48 hours.MTT assay was used to observe cell proliferation.The median inhibitingconcentration（IC50）was calculated.Western blot assay was used to detect the expressions of P38MAPK，P-P38MAPK and α-smooth muscle actin（α-SMA）in control group，high-glucose group and S30 group.The expression of α-SMA was also detected by the method of immunofluorescence.Results1.Compared with control group，there was no significant inhitory effect on proliferation rate in DMSO group（P＞0.05）.There were increased HK-2 cells in high glucose group and S5group（P＜0.05）.Proliferation rates were significantly decreased in S20 and S30 groups（P＜0.05）.Compared with high glucose group，the proliferation rates of HK-2 cells were inhibited in S5，S10，S20 and S30 groups（P＜0.05）.2.The expression of P-P38MAPK was significantly higher in high glucose group and S30 group than that of control group（P＜0.05）.Compared with high glucose group，the expression of P-P38MAPK was significantly decreased in S30 group（P＜0.05），whereas no significant difference in the expression of P38MAPK between the two groups（P＞0.05）.3.Compared with control group，the expression of α-SMA was significantly increased in high glucose group and S30 group（P＜0.05）.Compared with high glucose group，the expression of α-SMA was significantly decreased in S30 group（P＜0.05）.ConclusionThe 30 mmol/L GS can lead to TEMT in HK-2 cells.The more suitable inhibitory concentration of SB203580 in the process of TEMT is 30μmol/L.SB203580 can slowdown the process of TEMT by inhibiting P38MAPK activation and inhibiting proliferation and the expression of α-SAM s of HK-2 cells.
Key words:diabetic nephropathy；kidney tubules；epithelial cells；epithelial-mesenchymaltransition；P38MAPK；SB203580
中图分类号：R692
文献标志码：A
DOI：10.11958/20150004
基金项目：石河子大学科学技术研究发展计划基金资助项目（2013ZRKXYQ-YD16）
作者单位：石河子大学第一附属医院肾病科（邮编832008）
作者简介：贾林（1989），女，硕士在读，主要从事肾小管疾病研究
通讯作者E-mail:sbkyxp@163.com
