霍会永 ，刘冰 ，曹凌 ，赵现 ，曹妍 ，薛靖 ，王如科 ，李军涛 △
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是老年人群中常见的一种中枢神经系统退行性病变，临床上以记忆力减退，语言功能障碍和认知能力降低为主要表现，部分患者甚至出现行为和人格改变，严重影响了患者生活质量［1］。随着我国逐渐步入老龄化社会，AD患者的发病人数也呈逐年增加之势。有关AD的发病机制尚不十分清楚，其主要病理改变为大脑皮质和海马区老年斑形成［2］。β-淀粉样蛋白（βamyloid protein，Aβ）是具有强自聚性的难溶蛋白，是构成老年斑的主要成分，降低脑内Aβ的蓄积能够有效延缓病程进展［3］。γ-分泌酶是调节Aβ生成的限速酶，对体内Aβ的平衡具有重要的调节作用［4］。近年来有研究发现，细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，CD147）可通过调节γ-分泌酶的生物活性，调节Aβ的生成，从而参与AD的发生、发展［5-6］。本文通过对AD模型大鼠脑室注射CD147 cDNA，以观察其对模型大鼠学习记忆能力的干预，以及对大鼠脑组织Aβ和γ-分泌酶表达的影响，从而为AD的临床治疗提供思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物与试剂 Sprague-Dawley二级健康雄性大鼠60只，月龄5～6个月，均购自中国科学院北京斯莱克实验动物中心（SCXK京2011-0012）。大鼠适应性饲养2周后用于实验。CD147 cDNA委托上海吉玛制药技术有限公司设计合成。TRIzol总RNA提取试剂购自美国Invitrogen公司。逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒均购自美国ABI Applied Biosystems公司。兔抗大鼠一抗（抗Aβ、抗γ-分泌酶），辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗，DAB显色试剂盒均购自美国Santa Cruz公司。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组、模型制备及给药 采用随机数字表法将60只大鼠分为假手术组、模型组及CD147组，每组20只。参照文献［7］制备AD大鼠模型，取模型组和CD147组大鼠，10%水合氯醛（0.3 g/kg）腹腔注射麻醉，俯卧固定于鼠脑立体定位仪上。参照鼠脑立体定位仪图谱，于前囟门后3.5 mm和中线右侧2 mm处垂直进针，通过微量注射器于双侧海马CA1区注入10µg的Aβ1～40，假手术组大鼠双侧海马CA1区注入10µg生理盐水，其余操作同模型组和CD147组。CD147组大鼠术后48 h，通过微量注射器于双侧脑室注射CD147 cDNA，模型组和假手术组大鼠于同一部位注射等量生理盐水。术毕，牙科泥封住颅骨孔，抗生素预防感染。
1.2.2 大鼠学习记忆能力测试 采用Morris水迷宫实验进行学习记忆能力测试。水迷宫为一圆形水池，直径1.8 m，高0.55 m。距池壁0.35 m处放一圆形平台，直径0.1 m，高0.29 m。所有大鼠训练5 d，每天上午训练2次，下午训练2次，相邻两次训练间隔1 min。训练时将大鼠面向池壁放入水中，观察其爬上圆形平台所需时间（即逃避潜伏期）。如果2 min内仍未找到圆形平台，则将其引导至圆形平台，潜伏期记为2 min。训练5 d后，撤除圆形平台，在训练时的同一入水点，大鼠面向池壁入水，观察其在2 min内跨过原圆形平台所在位置的次数。
1.2.3 Western blot检测蛋白表达 Morris水迷宫实验结束后，3组大鼠各取15只，腹腔麻醉后处死，取出包含海马组织的脑组织，置入玻璃匀浆器碾碎，冰浴下加裂解液。裂解30 min，转移至离心管，4℃下10 000 r/min离心5 min，取上清蛋白液。BCA法测定蛋白浓度，-20℃保存备用。100µg蛋白上样，经8%的SDS-PAGE电泳分离，转至PVDF膜。TBST漂洗，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，兔抗大鼠一抗（抗Aβ、抗γ-分泌酶）工作液，4℃孵育过夜。TBST漂洗，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗工作液，37℃孵育1 h。TBST漂洗，暗室内ECL显色、曝光。Image J软件分析条带光密度（OD）值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白光密度值/内参βactin光密度值。
1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠逃避潜伏期时间比较 各组大鼠逃避潜伏期时间随着训练时间的增加均缩短。从第3天开始，模型组大鼠逃避潜伏期时间较假手术组延长，而CD147组较模型组减少，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。
Tab.1 The comparison of escape latencies between three groups表1 各组大鼠逃避潜伏期时间比较（n=20，s，±s）
Tab.1 The comparison of escape latencies between three groups表1 各组大鼠逃避潜伏期时间比较（n=20，s，±s）
＊＊P＜0.01；a与假手术组比较，b与模型组比较，P＜0.05；表2、3 同
2.2 各组大鼠空间探寻能力比较 模型组大鼠经过平台次数和经平台停留时间较假手术组减少，而CD147组较模型组均增加，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。
2.3 各组脑组织Aβ和γ-分泌酶表达比较 模型组大鼠脑组织Aβ和γ-分泌酶表达较假手术组增加（P＜0.05），而CD147组较模型组减少，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3、图 1。
Tab.2 The comparison of spatial searching abilities between three groups表2 各组大鼠空间探寻能力比较（±s）
Tab.2 The comparison of spatial searching abilities between three groups表2 各组大鼠空间探寻能力比较（±s）
Tab.3 ComparisonofexpressionsofAβandγ-secretasein brain tissues of rats between three groups表3 各组大鼠脑组织Aβ和γ-分泌酶表达比较 （±s）
Tab.3 ComparisonofexpressionsofAβandγ-secretasein brain tissues of rats between three groups表3 各组大鼠脑组织Aβ和γ-分泌酶表达比较 （±s）
Fig.1 Comparison of expressions of Aβ and γ-secretase in brain tissues of rats between three groups图1 各组大鼠脑组织Aβ和γ-分泌酶表达比较
3 讨论
学习记忆能力下降是AD患者早期认知功能损害的主要临床特征。本研究通过海马区注射Aβ1～40，制备 AD 模型大鼠，Morris水迷宫实验结果显示，AD模型大鼠逃避潜伏期时间较假手术组显着延长，经过平台次数和经平台停留时间较假手术组明显减少，表明AD模型大鼠出现明显的学习记忆能力减退。通过对AD模型大鼠双侧脑室注射CD147 cDNA，观察其对AD模型大鼠学习记忆能力的影响，结果发现，CD147组大鼠逃避潜伏期时间较模型组大鼠显着减少，经过平台次数和经平台停留时间较模型组大鼠显着增加，表明外源性CD147 cDNA能够显着提高AD模型大鼠记忆学习能力，减轻Aβ1～40所致的学习记忆障碍。
有关AD的病因迄今尚不明确，一般认为AD是由于遗传、免疫、环境等多种因素所致的复杂性病变。研究指出，Aβ在大脑皮质和海马区沉积是引起AD发病的关键因素［8］。Aβ由39～43个氨基酸残基形成，其C-末端存在12个疏水氨基酸残基，N-末端存在28个氨基酸残基位于细胞膜外，所以具有很强的自聚性，易在脑组织形成难溶性的淀粉样纤维沉积物［9］。Aruoma 等［10］研究显示，脑组织 Aβ 沉积可引起淀粉样血管炎，直接引起脑组织血供、氧供障碍。谭展望等［11］认为Aβ可促进Bax表达而抑制Bcl-2表达，从而诱导神经元细胞凋亡。Arora等［12］研究显示，Aβ可损害胆碱能神经，而后者与人类学习和记忆功能紧密相关。本研究结果显示，模型组大鼠脑组织Aβ表达较假手术组显着增加，这也证实了Aβ可能参与了AD的发生、发展；而CD147组大鼠脑组织Aβ表达较AD模型大鼠显着降低，说明外源性CD147 cDNA可显着减少脑组织Aβ表达，减轻Aβ沉积所引起的大鼠记忆学习障碍。
γ-分泌酶主要参与体内多个重要跨膜蛋白的切割，可切割C99而生成Aβ，是调节Aβ生成的限速酶［13］。所以γ-分泌酶的生物活性对Aβ的生成和AD的发病均至关重要。CD147是一种跨膜糖蛋白，在多种组织和细胞中均有表达，与肿瘤的发生、视网膜功能和多种神经退行性疾病等密切相关。有研究认为CD147参与了对γ-分泌酶生物活性的调控。Zhou等［14］干扰 HeLa细胞 CD147表达，发现细胞γ-分泌酶表达显着增加，而Aβ的生成亦明显增加。张锦巍等［15］过表达小鼠胚胎成纤维细胞CD147，发现细胞γ-分泌酶表达下降，同时Aβ的生成明显减少。智孔亮等［16］通过CD147 cDNA转染人神经母细胞瘤细胞，结果发现γ-分泌酶和Aβ的表达均明显减少。本研究结果显示，CD147组大鼠脑组织γ-分泌酶表达较AD模型大鼠显着降低，这也证实了在AD模型大鼠脑组织中存在同样的表达调控，即CD147对γ-分泌酶的活性起着负调节作用。
综上所述，外源性CD147能够显着改善AD模型大鼠学习记忆能力，其具体机制可能与调节γ-分泌酶活性和下调Aβ的表达有关。
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