阿霉素修饰纳米银的制备及其体外抗肿瘤活性研究

杨丽军，禇丽萍，王婧，任春华，王中强，黄帆

据美国抗癌协会统计显示，癌症已成为人类最为致命的疾病［1］，而癌症治疗一直以来都是一个巨大的挑战。近年来，随着纳米技术的发展，纳米药物引起了研究者越来越多的关注。通过物理包裹或化学键合的方式将传统化疗药［阿霉素（DOX）、紫杉醇、喜树碱等］［2］负载到纳米粒上，即可方便地制得纳米抗癌药，不仅提高了疏水性化疗药在体内的溶解度和稳定性［3］，而且能利用纳米材料独有的血液长循环能力和增强渗透滞留（EPR）效应在肿瘤组织高效富集［4］，从而提高了化疗药的生物利用度，同时降低了其对正常组织的毒副作用。最近，研究者发现广谱抗菌剂纳米银（Ag NPs）具有良好的抗肿瘤效果［5-6］。尽管其抗肿瘤机制尚不明确，但一般认为Ag NPs能够很容易地进入肿瘤细胞，促进细胞内活性氧（ROS）的产生，从而不可逆地诱导细胞凋亡和坏死［7］。基于DOX和Ag NPs的抗肿瘤活性，Badiger课题组［8］及Mamdouh课题组［9］均通过静电吸附作用将DOX负载到Ag NPs表面，制备出联合抗肿瘤药物。然而，该药物存在生理稳定性较差及难以在肿瘤组织特异性释放DOX的缺点，大大限制了其应用前景。鉴于硫辛酰肼（LA-NHNH2）的酰肼基团能够与DOX的羰基形成具有酸敏感的腙键，且其硫原子（S）能够与银（Ag）形成稳定的Ag-S键，因此，本实验拟在LA-NHNH2的两端分别以化学键连接Ag NPs和DOX，制备一种生理稳定性好且具有pH响应性的阿霉素-纳米银（DOX-Ag NPs）联合抗肿瘤药物，通过噻唑蓝比色法比较该纳米抗癌药与单一的Ag NPs及DOX的抗肿瘤活性，从而为临床肿瘤治疗提供新的研究思路和方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 DOX·HCl、硝酸银（AgNO3）、柠檬酸钠（Na3C6H5O7·2H2O）、硼氢化钠（NaBH4）、硫辛酸（LA）、N，N’-二环己基碳酰亚胺（DCC）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）购自于百灵威科技有限公司；巯基聚乙二醇（PEG-SH，相对分子质量为2 000）购自于上海炎怡生物科技有限公司；水合肼（NH2NH2·H2O）、无水甲醇（MeOH）、无水乙醇（EtOH）、三氟乙酸（TFA）等其他化学试剂均购自于天津江天化工技术有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS）、噻唑蓝（MTT）购自于北京索莱宝科技有限公司；人肝癌HepG2细胞为实验室自有。

1.1.2 仪器 超纯水仪（Merck Instrument，德国）；300 MHz核磁共振波谱仪（Bruker Instrument，德国）；液质联用仪（AB Sciex Instrument，美国）；动态光散射粒度仪（Malvern Instrument，英国）；紫外-可见分光光度计（Shimadzu Instrument，日本）；荧光分光光度计（Shimadzu Instrument，日本）；电感耦合等离子体发射光谱仪（PerkinElmer Instrument，美国）；透射电子显微镜（TEM，FEIInstrument，美国）；全波长多功能酶标仪（Thermo Scientific Instrument，美国）。

1.2 方法

1.2.1 硫辛酰肼-阿霉素（LA-NHN=DOX）的合成及表征 LA-NHN=DOX的合成路线见图1［10］。首先，称取LA（3.09 g，15 mmol）、EtOH（10.4 g，225 mmol）及 DMAP（0.92 g，7.5 mmol）溶于120 mL二氯甲烷（CH2Cl2）中，0℃下滴加含DCC（4.63 g，23 mmol）的CH2Cl2（30 mL）溶液，0℃下搅拌反应1 h后室温下继续反应24 h，过滤除去反应沉淀，滤液经过旋蒸脱除溶剂以及硅胶柱层析纯化（淋洗液为体积比15∶1的石油醚和乙酸乙酯）得到黄色油状产物硫辛酸乙酯（LACOOEt），产率为81%。然后，将LACOOEt（2.96 g，12.7 mmol）溶于 MeOH（50 mL）中，加入 NH2NH2·H2O（4.3 mL），40℃下搅拌反应过夜，加入水淬灭反应并用乙酸乙酯萃取3次，收集的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤2次，经无水硫酸镁干燥、旋蒸脱除溶剂以及硅胶柱层析纯化（淋洗液为体积比15∶1的CH2Cl2和MeOH为淋洗液）得到黄色固体产物LANHNH2，产 率 为 83%。 最 后 ，将 LA-NHNH2（132 mg，0.6 mmol）和DOX·HCl（116 mg，0.2 mmol）溶于MeOH（30 mL）中，加入TFA（50µL），室温下避光反应24 h。反应液浓缩至1 mL并逐滴加入到乙腈（25 mL）中，得到的悬浮液在4℃冰箱中静置过夜，离心获得的红色固体用乙腈多次洗涤便可得到最终的目标产物LA-NHN=DOX，产率为72%。通过核磁氢谱（1H NMR）和高分辨质谱（HRMS）对终产物LA-NHN=DOX进行化学结构确证。

Fig.1 Thesynthetic routeof LA-NHN=DOX［10］图1 LA-NHN=DOX的合成路线［10］

1.2.2 Ag NPs的制备及表征 首先，以超纯水为溶剂，分别配置AgNO3溶液（0.25 mmol/L）、Na3C6H5O7·2H2O溶液（0.31 mmol/L）及NaBH4溶液（0.25 mmol/L），4℃下避光静置1 h。然后，将AgNO3溶液（100 mL）和Na3C6H5O7溶液（100 mL）加入到500 mL圆底烧瓶中，剧烈搅拌下快速加入NaBH4溶液（6 mL），室温下搅拌反应10 min后加热至沸腾，继续搅拌反应1.5 h，随后冷却至4℃，避光静置过夜便可得到以Na3C6H5O7为稳定剂的Ag NPs溶液。最后，剧烈搅拌下向上述Ag NPs溶液中滴加4 mL PEG2000-SH（2.8 mg，1.4 µmol）水溶液，室温下反应12 h，采用截留相对分子质量为3 500的透析袋对上述混合溶液进行透析，除去游离化合物，便可制得最终以PEG为稳定剂的Ag NPs溶液［11-12］。通过动态光散射（DLS）和TEM分析Ag NPs的粒径和形貌；通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测定Ag NPs溶液中的Ag含量；通过电位仪测定Ag NPs的ζ-电位；通过紫外-可见吸收光谱表征Ag NPs的光学性质。

1.2.3 DOX-Ag NPs的制备及表征 剧烈搅拌下向Ag NPs溶液（10 mL）中滴加2 mL LA-NHN=DOX（746 µg，1 µmol）MeOH溶液，室温下反应12 h，采用截留相对分子质量为3 500的透析袋对上述混合溶液进行透析，除去游离的LANHN=DOX分子，便可得到DOX-Ag NPs溶液。通过DLS和TEM分析DOX-Ag NPs的粒径和形貌；通过ICP-MS测定DOX-Ag NPs溶液中的Ag含量；通过电位仪测定DOX-Ag NPs的ζ-电位；通过紫外-可见吸收光谱和荧光光谱表征DOX-Ag NPs的光学性质。

1.2.4 体外药物释放实验 取6份DOX-Ag NPs溶液（3 mL）装入截留相对分子质量为3 500的透析袋中，将其中3份分别置于装有50 mLPBS（pH 7.4）的烧杯中，另外3份分别置于装有50 mL PBS（pH 5.5）的烧杯中，37℃恒温震荡，于不同时间点取出定量释放液，同时向烧杯中补充等体积的相应PBS缓冲液。利用荧光分光光度计测定释放液中游离DOX的荧光强度，并结合标准曲线（DOX荧光强度-DOX浓度），检测不同时间DOX的释放量并绘制释放曲线。

1.2.5 体外抗肿瘤实验 取人肝癌HepG2细胞，用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养细胞，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞以每孔5×103个接种于96孔板内，培养24 h后，向孔内分别加入一系列浓度梯度（按照DOX的浓度为0、0.1、0.5、1、2、5、10、20 mg/L）的DOX、Ag NPs（Ag NPs量取决于加入的DOX-Ag NPs量，两者的Ag浓度保持一致）和DOX-Ag NPs，培养箱内孵育24 h后，每孔加入20µL MTT溶液（5 g/L）继续培养4 h，弃去上清液后每孔加入150µL二甲基亚砜（DMSO），充分震荡后用酶标仪检测570 nm下各孔的吸光度（A）值。每个浓度设置6个复孔，根据公式计算每个浓度下的细胞生存率并绘制生存率曲线。细胞生存率=实验组A平均值/对照组A平均值×100%。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0软件处理数据，并进行统计学分析。实验数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LA-NHN=DOX的合成及结构表征 LANHN=DOX的1H NMR谱见图2，具体数据为：1H NMR（300 MHz，DMSO）δ14.11（d，J=1.6 Hz，1H），13.32（s，1H），10.33（s，1H），8.02～7.93（m，3H），7.91～7.87（m，2H），7.67～7.61（m，1H），5.82（t，J=4.6 Hz，1H），5.57（s，1H），5.49（d，J=5.7 Hz，1H），5.33～5.27（m，1H），4.97～4.88（m，1H），4.46～4.33（m，2H），4.08～4.00（m，1H），3.96（s，3H），3.61～3.57（m，1H），3.29（d，J=18.1 Hz，1H），3.12～3.02（m，2H），2.73（d，J=17.3 Hz，1H），2.30～2.21（m，2H），2.19～2.07（m，2H），1.95～1.80（m，2H），1.76～1.66（m，2H），1.57～1.50（m，1H），1.45～1.39（m，1H），1.37～1.26（m，3H），1.21～1.09（m，5H）；通过HRMS在746.275 6处检测到分子离子峰，与［LA-NHN=DOX+H+］理论相对分子质量746.241 2相一致；1H NMR和HRMS均证明了LA-NHN=DOX的成功合成。

Fig.2 1H NMRspectraof compound LA-NHN=DOX图2 化合物LA-NHN=DOX的核磁共振氢谱

2.2 Ag NPs及DOX-Ag NPs的表征 通过DLS表征Ag NPs的粒径为（32.3±2.5）nm，分布指数（PDI）为0.29，DOX-Ag NPs的粒径为（40.4±3.8）nm，PDI为0.54，DOX-Ag NPs的粒径较Ag NPs增大（t=3.084，n=3，P＜0.05），见图3。TEM镜下可见两种纳米粒均为球形结构，且分布均匀无聚集现象，测得的Ag NPs的粒径为（19.3±2.1）nm，DOX-Ag NPs的粒径为（20.1±1.8）nm，见图4。Ag NPs及DOX-Ag NPs的表面电荷分布存在明显不同，通过电位仪测得两者的ζ-电位分别为（-1.2±0.7）mV和（15.8±0.9）mV。从紫外-可见吸收光谱可知，Ag NPs的最大吸收波长为403 nm，而DOX-Ag NPs的最大吸收波长稍有红移，为416 nm，且在480 nm处DOX-Ag NPs的吸光度（0.254）明显大于Ag NPs的吸光度（0.151），见图5。两者的荧光发射光谱见图6，在484 nm波长激发下，游离DOX分子在590 nm处出现最大荧光发射峰，而DOX-Ag NPs上的DOX荧光强度明显降低（由9 888降为1 633）。此外，通过ICP-MS测得Ag NPs和DOX-Ag NPs的银浓度分别为18 mg/L和13 mg/L。

2.3 体外药物释放实验 通过透析法结合荧光光谱检测DOX-Ag NPs在不同pH下的DOX累积释放率，结果见图7。37℃下，在不同pH的PBS中，随着时间的延长，DOX的累积释放率均不断升高，但pH5.5下DOX的释放速度明显快于pH 7.4下DOX的释放速度。48 h后，pH 7.4下DOX累积释放率为（33.0±3.0）%，而在pH 5.5下DOX累积释放率可达（65.0±2.8）%。

Fig.3 Hydrodynamic sizedistributionsof Ag NPs and DOX-Ag NPs图3 Ag NPs及DOX-Ag NPs的粒径分布

Fig.4 TEM imagesof Ag NPs(A)and DOX-Ag NPs(B)图4 Ag NPs（A）及DOX-Ag NPs（B）的TEM照片

Fig.5 UV-vis absorption spectraof Ag NPsand DOX-Ag NPs图5 Ag NPs及DOX-Ag NPs的紫外-可见吸收光谱

Fig.6 Fluorescencespectraof DOX and DOX-Ag NPs图6 DOX及DOX-Ag NPs的荧光光谱

Fig.7 DOX releaseprofiles of DOX-Ag NPsat pH 7.4 or pH 5.5图7 DOX-Ag NPs中DOX在pH 7.4及pH 5.5下的释放曲线

2.4 体外抗肿瘤实验 DOX、Ag NPs和DOX-Ag NPs对HepG2细胞的增殖抑制均呈现明显的浓度依赖性，DOX及Ag的浓度越高，细胞生存率越低。当DOX浓度为0 mg/L时，3组间细胞生存率差异无统计学意义；当DOX浓度为0.1 mg/L（Ag浓度为0.09 mg/L）时，Ag NPs组细胞生存率高于DOX组，DOXAg NPs组细胞生存率低于Ag NPs组（P＜0.05），与DOX组差异无统计学意义；在其他浓度下，Ag NPs组细胞生存率均高于DOX组，DOX-Ag NPs组均低于DOX组和Ag NPs组（均P＜0.05）。见图8。

Fig.8 Comparison of theeffects of DOX,Ag NPs and DOX-Ag NPson survival ratesof HepG2 cells图8 DOX、Ag NPs和DOX-Ag NPs对HepG2细胞的生存率影响比较

3 讨论

与单一疗法相比，多种药物的联合治疗是一种更为有效的癌症治疗方法，原因是联合治疗过程中，各种药物不仅能发挥协同治疗效果，而且药物用量低，毒副作用小［13］。之前基于DOX和Ag NPs联合抗肿瘤的研究中，均是通过静电吸附作用将DOX负载到Ag NPs表面。然而，由于静电作用力较弱，导致DOX-Ag NPs生理稳定性较差，DOX易泄漏。此外，上述DOX-Ag NPs不具有肿瘤pH环境响应性，不能在肿瘤组织特异性释放药物，降低了治疗效果的同时也增加了对正常组织的毒副作用，大大限制了其应用前景。本研究所制备的具有pH响应性的DOX-Ag NPs联合抗肿瘤纳米药物不仅保持了纳米药物体内长循环和通过EPR效应靶向肿瘤的能力，而且由于DOX是通过化学键连的方式负载，DOXAg NPs的生理稳定性得到提升。此外，DOX-Ag NPs的pH响应特性使DOX能够特异性地在肿瘤组织中释放，减少了药物在体循环过程中的泄漏，降低了对正常组织的毒副作用［14］。

本研究中LA-NHN=DOX的1H NMR数据与文献［10］报道一致，且通过HRMS检测到746.275 6处的分子离子峰与［LA-NHN=DOX+H+］理论相对分子质量746.241 2相一致，证明了LA-NHN=DOX的成功合成。通过材料表征可以发现，DOX-Ag NPs的粒径较Ag NPs增大，说明DOX成功负载到Ag NPs上。值得注意的是，由DLS测得的粒径大于由TEM测得的粒径，原因是纳米粒在水中处于溶胀状态，DLS测得的是其水合粒径，而TEM测试采用的是干燥样品，制样过程中纳米粒收缩，导致测得的粒径偏小。负载上DOX之后，纳米银的ζ-电位由（-1.2±0.7）mV增大到（15.8±0.9）mV，原因是DOX分子上的氨基带正电荷，DOX的成功负载增加了纳米银表面的正电荷数目。DOX-Ag NPs的紫外-可见吸收峰为416 nm，且在480 nm处的吸光度较Ag NPs大，分别与典型的纳米银最大吸收波长［15］和DOX最大吸收波长［16］相符合，进一步证明DOX已成功负载到Ag NPs上。DOX-Ag NPs上的DOX荧光强度明显低于游离DOX的荧光强度，原因是DOX与Ag NPs之间存在强烈的共振能量转移［17］，导致DOX荧光被淬灭。

基于肿瘤组织弱酸性的特点，用pH 5.5的PBS模拟肿瘤微环境，pH 7.4的PBS模拟正常生理条件。药物释放实验结果表明，DOX-Ag NPs在弱酸性环境中能够快速释放出DOX，这主要是因为LANHN=DOX分子中的腙键具有酸敏感性［18］，能够在酸性条件下发生断裂，从而加速了DOX的释放。该纳米抗癌药在正常生理环境中DOX释放缓慢，有利于延长血液循环时间，增加在肿瘤部位的富集；而一旦到达肿瘤组织，便能够在肿瘤弱酸性环境中快速释放出DOX，发挥抗肿瘤活性。利用体循环与肿瘤微环境之间存在的pH梯度，便可实现抗癌药物DOX的可控性释放。

体外抗肿瘤结果显示，DOX-Ag NPs具有较游离DOX及Ag NPs更好的肿瘤细胞增殖抑制效果，这主要是由于DOX-Ag NPs既能发挥DOX破坏细胞DNA的功能，还能通过Ag NPs促进细胞内ROS的产生，从而对肿瘤细胞进行联合杀伤。此外，游离DOX受到水溶性影响，杀伤作用受到限制，降低了其抗肿瘤效果。

本课题制备的DOX-Ag NPs是一种有效的联合抗肿瘤纳米制剂，能够将DOX和Ag NPs稳定结合，并通过其酸敏感的特性在肿瘤部位智能释放药物，为基于纳米银的抗癌药物的合理设计提供了有益的借鉴，值得进行深入探究。

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