基于α-突触核蛋白的帕金森病动物模型研究进展

杜可晨，邹春林△

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是发病率仅次于阿尔茨海默病的第二常见神经退行性疾病［1］。目前，PD的病因及确切发病机制尚不清楚，其主要临床症状包括运动症状（运动迟缓、静止性震颤、肌强直和姿势步态异常等）和非运动症状（自主神经功能障碍、嗅觉障碍、便秘和快速眼动期睡眠行为障碍等）。PD的主要病理学特征是黑质致密部多巴胺神经元的变性丢失及路易小体（Lewy bodies，LBs）形成。而α-突触核蛋白（α-synuclein，α-syn）是LBs的主要组成成分，且α-syn的基因点突变（A30P、E46K、H50Q、G51D、A53E和A53T）与家族性PD的发病密切相关，α-syn参与了PD的发病。近年来，已有大量研究利用α-syn的异位表达、过表达或脑内注射等方法来建立PD动物模型，这些模型与传统化学毒素模型相比，能够更好地复制PD患者的特征性病理改变。本文基于α-syn的PD动物模型的研究进展进行综述。

1 α-syn概述

1.1 α-syn的基本结构 α-syn是由140个氨基酸构成的蛋白，并且是一种具有多种构象的蛋白，包括单体、寡聚体、多聚体、原纤维、不溶性原纤维等。有研究表明，α-syn各组分间存在动态平衡，正常情况下不具有聚集倾向，当寡聚体与单体比例失调时会引起聚集，形成的原纤维可损害神经元并导致疾病进展［2］。α-syn由3个结构域组成：N端与脂质结合的α螺旋结构域、非淀粉样β蛋白结构域、非结构化C端。N端在膜上起结合的作用，含有7个重复序列，每个序列包含11个氨基酸，而非结构化C端含有大量带电残基，这些残基有助于抑制原纤维的形成，是重要的翻译后修饰结构。

1.2 α-syn的生理功能 α-syn的生理功能尚未被完全揭示。已有研究证明α-syn能抑制胞吐融合孔的关闭，促进胞吐作用［3］。同时α-syn可调节多巴胺（dopamine，DA）转运体，影响神经末梢摄取DA的效率。α-syn的C端与α-晶体蛋白部分结构相似，具有保护细胞内蛋白免受温度变化和氧化应激影响的作用。α-syn作为腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）合成的生理调节因子，能在线粒体中影响ATP合成的效率［4］，同时也参与正常的脂肪酸摄取、转移及代谢；且能控制神经递质释放［5］。Bi等［6］发现α-syn能诱导p38丝裂原活化蛋白激酶激活Ser131磷酸化的Parkin基因，使E3泛素连接酶失活，并进一步降低二价金属转运体-1（divalent metal transporter 1，DMT1）的泛素化水平。DMT1稳定性的改变和细胞对铁摄取的改变能影响脑中铁稳态，因此α-syn可能在黑质（Substantia nigra，SN）中参与PD相关的铁沉积以及铁代谢功能障碍。

1.3 α-syn的病理功能 Logan等［3］发现外源性或过表达α-syn可以促进胞吐融合孔的扩张，促进胞吐作用。异常聚集的α-syn能增强细胞核周围和树突中线粒体的氧化应激。α-syn低聚物会导致线粒体破碎，产生的碎片又进一步引起更多线粒体发生功能障碍与死亡。α-syn以剂量依赖性方式抑制囊泡从内质网转运至高尔基体，使囊泡在质膜附近堆积成囊泡簇。免疫荧光显示囊泡簇与α-syn及不同的囊泡标志物相关，表明α-syn能影响囊泡运输的步骤。α-syn的错误折叠会形成毒性淀粉样蛋白聚集体，这些聚集体在神经元中沉积并引发神经元功能障碍，最终过表达的α-syn与其他蛋白形成LBs并沉积在神经突中，阻碍DA代谢和神经元的正常功能，导致神经元死亡。

正常情况下，过表达或错误折叠的α-syn会通过自噬-溶酶体途径（autophagy-lysosome pathway，ALP）降解。ALP是对胞浆内大分子蛋白和细胞器等进行降解的一种途径，可以通过溶酶体清除多种α-syn聚集体。因此，ALP受损会导致α-syn在细胞中过表达及异常聚集而产生神经毒性。异常聚集的α-syn又能阻断葡萄糖脑苷酶1等水解酶从内质网转运到溶酶体，降低溶酶体的降解能力，进一步引发溶酶体清除过表达或错误折叠的α-syn的能力下降［7］。因此ALP受损与病理性α-syn聚集可能共同加速了神经元受损，导致严重的神经元病变。

2 基于α-syn的PD动物模型

研究人员已建立了多种PD动物模型，包括秀丽隐杆线虫、果蝇、斑马鱼等低等动物，小型猪、狗、啮齿类和非人灵长类（non-human primates，NHPs）等高等哺乳动物。啮齿类动物体型较小、易于饲养，解剖结构与人类相近，因此成为PD研究中最经典的动物模型之一，常用啮齿类动物有小鼠与大鼠。NHPs是与人类最为接近的动物，能够更好地复制PD患者的特征性病理改变，但因饲养难度大且成本较高，目前研究数量相对较少。低等动物虽然结构简单，但能与高等动物模型形成互补，如秀丽隐杆线虫体壁透明可用于追踪显示荧光蛋白，弥补高等动物模型中难以体内示踪的缺陷。

基于α-syn的PD动物模型与其他药物构建的PD模型存在一定区别。神经毒素类（6-羟基多巴胺、1,4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶、杀虫剂等）模型造模速度快，但仅能模拟PD症状，不能很好地模拟PD特征性的病理改变；而基于α-syn的PD动物模型虽然造模速度较慢，但可造成PD特征性的病理改变并引起PD症状，相比神经毒素模型能更好地模拟PD患者的病程发展。以下主要讨论基于α-syn的啮齿类及NHPs的PD模型的研究进展。

2.1 基于α-syn的啮齿类动物PD模型

2.1.1 转基因模型 啮齿类动物是目前最常用的实验哺乳动物。已有研究利用转基因技术在啮齿类动物脑中过表达野生型（Wild Type，WT）、A53T、A30P或E46K突变型α-syn，可部分引起纹状体DA含量减少、黑质神经元变性和运动功能障碍等一系列特征性的PD生化、病理和行为学改变。Masliah等［8］首先成功建立了过表达WTα-syn转基因小鼠模型，并在该模型中观察到部分PD特征性病理改变，如在新皮质、海马及黑质神经元内形成α-syn阳性包涵体和泛素阳性包涵体；此外，基底节内也可见纹状体多巴胺能神经元末梢丢失，但黑质部位多巴胺能神经元无明显减少，且未见典型的LBs形成，行为学异常也仅在高表达α-syn的转基因小鼠中观察到。van der Putten等［9］建立了Thy1调控序列作用下过表达A53T突变型的人源性α-syn转基因小鼠模型，该转基因小鼠的黑质多巴胺能神经元缺乏A53T突变型的人源性α-syn表达，但在黑质之外的脑区却具有与Lewy体病患者大脑相似的α-突触核蛋白病病理改变；此外，该模型可表现出明显的运动功能障碍，表明此模型可作为研究α-突触核蛋白病的一个较好的小鼠模型。虽然上述转基因小鼠模型能出现PD的一些特征性病理改变（如神经元内α-syn的聚集和α-syn包涵体形成等）以及运动障碍，但这些模型大多缺乏特异性的黑质多巴胺能神经元损伤和丢失，因此与PD患者的临床病理改变仍有明显区别。

2.1.2 腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）模型 由于AAV具有体积小、感染效率高、很少整合到宿主基因组中，并能感染分裂细胞和非分裂细胞等优势，近年来许多研究者开始通过AAV介导WT或突变型α-syn在中脑黑质中过表达，从而导致黑质多巴胺能神经元的丢失，以期建立能够更好模拟PD特征性病理改变的动物模型。van der Perren等［10］将编码A53T突变型α-syn的重组腺相关病毒载 体 2/7（recombination adeno-associated virus，rAAV）通过脑立体定位，定向注射到大鼠黑质部位，模型鼠在注射3周后出现明显的运动障碍，注射4周后对侧前爪使用率减少50%，且使用左旋多巴治疗可使前爪功能完全恢复；注射29 d后，大鼠黑质内80%的酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）阳性神经元死亡；注射32 d后，通过影像学发现尾壳核内DA转运体结合率降低了85%；此外，在黑质中出现了α-syn异常聚集体，且17 d后在黑质中可见硫代黄素S染色呈阳性的α-syn异常聚集体。以上结果表明通过rAAV介导，在黑质部位过表达A53T突变型α-syn可高效建立具有特征性病理和行为学改变的PD动物模型。Ip等［11］将编码A53T突变型α-syn的AAV 1/2立体定向注射到小鼠黑质部位，10周后整个黑质与纹状体中均发现A53T突变型α-syn，免疫荧光染色发现TH阳性神经元与A53T突变型αsyn存在共定位，TH阳性神经元密度降低了20%，且纹状体中DA水平减少约40%，通过放射自显影分析，DA转运体结合率降低了29%；同时可观察到小鼠黑质神经元产生LBs样结构以及营养不良性神经突起，行为学检测可见小鼠左前爪使用率下降。该研究在小鼠中诱导出了PD样的病理及行为学改变，成功构建了基于α-syn的PD小鼠模型。由于在PD前驱阶段蓝斑去甲肾上腺素能神经元的退行性改变可引起一系列非运动症状（抑郁症、焦虑和睡眠障碍等），因此Henrich等［12］建立了第一个小鼠蓝斑中过表达α-syn的动物模型，该研究将编码A53T突变型α-syn的AAV1/2注射到小鼠蓝斑中，结果发现注射3周后蓝斑中TH阳性细胞减少约15.86%，6周后减少约34.84%，9周后减少约56.25%；该研究还发现蓝斑神经元中出现磷酸化的α-syn聚集以及反应性小胶质细胞和星形胶质细胞增生；但该研究未发现黑质中TH阳性神经元明显减少，这可能与实验周期短有关。

与其他AAV相比，AAV2/DJ在体外有更高的转染效率。von Hovel等［13］首次利用AAV2/DJ作为载体在大鼠黑质过表达WTα-syn与E46K突变型αsyn，结果显示黑质神经元中均产生了具有蛋白酶K抗性的不溶性磷酸化α-syn，并出现LBs样病理改变；黑质纹状体TH免疫组化染色结果显示，在过表达WTα-syn的大鼠模型的黑质内TH阳性神经元数量呈进行性减少，12周时减少达40%，并且纹状体中TH阳性神经纤维也呈现相似的改变；而在过表达E46K突变型α-syn大鼠黑质纹状体内TH阳性神经元和神经纤维的数量在注射4周后不再减少；行为学方面，2个模型均出现了旋转行为学的改变，但在圆筒实验中，仅过表达WTα-syn的大鼠出现明显变化，TH阳性神经纤维在第4周降低至67.0%，第8周进一步降低至58.7%，第12周下降至44.1%，提示WTα-syn大鼠神经元正在持续退化，这些结果表明过表达E46K突变型α-syn的大鼠模型可作为前驱期PD模型，而过表达WTα-syn的大鼠模型可作为早期PD模型。

2.2 基于α-syn的NHPs的PD模型 NHPs动物在神经系统解剖结构、运动及非运动行为学方面与人类非常接近，因此作为神经系统疾病模型有着其他动物所无法比拟的优势。Kirik等［14］通过向成年狨猴大脑的黑质中注射编码WT和A53T突变型α-syn的rAAV建立了第一个NHPsα-syn过表达模型；该研究发现在注射WT和A53T突变型α-syn-rAAV 16周后，狨猴均出现了明显的PD样病理改变，如αsyn阳性包涵体和颗粒状沉积物以及产生营养不良性神经突起，并且进一步通过体视学细胞计数，结果显示在注射WT和A53T突变型α-syn-rAAV的黑质中，TH阳性细胞数减少达32%~61%。Yang等［15］利用NHPs动物评价了不同年龄对过表达α-syn毒性的影响，将编码A53T突变型α-syn的慢病毒载体注射到不同年龄的恒河猴黑质部位，8周后所有过表达A53T突变型α-syn的猴脑内注射位点均可见路易神经突，并且路易神经突的密度随年龄的增长而增加；此外，反应性星形胶质细胞数量也随年龄增长而增加，并伴有明显的神经元轴突退行性病变；TH免疫组化染色结果显示，与对照组猴相比，过表达A53T突变型α-syn的实验组猴黑质DA神经元明显减少，这些结果表明老化可加速神经元中α-syn聚集。Bourdenx等［16］也将编码A53T突变型α-syn的AAV2/9病毒载体注射到青年和老年狨猴的黑质部位，但与Yang等［15］研究结果不同，该研究结果显示，青年狨猴与老年狨猴在黑质纹状体部位TH阳性神经元和神经纤维的丢失程度无明显差异，说明老化并不会加剧过表达α-syn的神经毒性。造成上述2个研究结果不同的原因可能是Yang等［15］用的是旧世界恒河猴，而Bourdenx等［16］用的是新世界狨猴，由于狨猴的α-syn天然带有A53T突变，因此可能对外源性过表达A53T突变型α-syn的毒性作用具有一定的拮抗能力。Koprich等［17］通过注射编码A53T突变型α-syn的AAV1/2病毒载体到食蟹猴黑质部位，成功构建了过表达A53Tα-syn的猴模型，研究显示该模型黑质DA能神经元丢失超过50%，纹状体DA减少超过60%，进一步表明在NHPs黑质纹状体过表达α-syn可建立用于研究PD特异性病理改变的NHPs动物模型。与上述研究不同，Collier等［18］通过注射rAAV-α-syn-shRNA到绿猴黑质部位，敲低内源性α-syn表达，结果发现在注射后3个月，黑质TH阳性神经元及纹状体TH阳性神经纤维明显减少，并且以黑质腹侧部TH阳性神经元减少最为明显；而在纹状体部位，壳核内TH阳性神经纤维的减少比尾状核更明显；因此，研究人员推测α-syn丧失正常功能可能是PD的病因之一，在PD患者脑内病理性α-syn聚集体可能通过吸附作用来阻止α-syn发挥正常的生理功能。

在α-syn转基因猴研究方面，Niu等［19］将编码A53T突变型α-syn的慢病毒载体注射到恒河猴卵母细胞中，并最终从75个胚胎中成功孕育出6只表达A53T突变型α-syn的转基因猴，虽然这些转基因猴没有出现明显的运动症状，但出现了年龄依赖的PD非运动症状（如认知缺陷和焦虑表型）。这些症状与PD患者早期出现的非运动症状相一致，因此这一转基因猴模型对于今后研究PD的早期病理改变有着重要价值。

3 基于α-syn预制原纤维的PD动物模型

3.1 啮齿类动物模型 正常情况下α-syn在细胞内以可溶性单体形式存在，当疾病状态下体内环境改变时，可溶性α-syn转化为寡聚中间体，寡聚中间体再延伸转化为不溶性的α-syn原纤维，然后进一步聚集形成α-syn包涵体。这种不溶性α-syn原纤维是LBs的主要成分，为了便于研究α-syn原纤维的致病机制，研究人员在体外合成了与α-syn原纤维高度相似的α-syn预制原纤维（α-Synuclein Preformed Fibrils，α-syn PFFs），并将其应用于各种PD细胞和动物模型的制作。Luk等［20］首次将α-syn PFFs添加到过表达α-syn的细胞培养体系中，结果显示α-syn PFFs可诱发细胞内源性α-syn的聚集，并形成LBs样细胞包涵体。Volpicelli-Daley等［21］在原代神经元培养体系中加入α-syn PFFs，结果显示α-syn PFFs可诱导形成不溶性的α-syn聚集体，并证实病理性α-syn聚集体能够在神经元之间传播，最终导致神经元缺失。上述细胞水平的实验证实了α-syn PFFs具有细胞毒性及在细胞间朊病毒样传播的特性。为了进一步在体内证实α-syn PFFs的这些生物学特性和功能，Luk等［22］首次将α-syn PFFs应用于PD小鼠模型的制作，结果显示在小鼠纹状体内注射α-syn PFFs可导致病理性α-syn在注射部位的神经元内聚集以及在相连脑区播散，并导致相应神经元发生退行性改变；其中黑质致密部DA能神经元的缺失直接导致了模型小鼠行为学改变，包括小鼠握力、平衡和协调能力下降，表明α-syn PFFs可用于制作PD动物模型。Masuda-Suzukake等［23］除将α-syn PFFs注射到小鼠黑质中外，还首次将路易体痴呆患者的脑组织提取物也注射到小鼠黑质部位，结果同样显示病理性α-syn可在多个脑区间传播，并导致神经元慢性退行性改变。但Luk等［22］的研究结果不同，模型小鼠未出现明显的行为学改变，可能是注射剂量和注射部位不同所致。Paumier等［24］进一步将α-syn PFFs注射到大鼠单侧纹状体内，也发现病理性αsyn出现广泛的不同脑区间的传播，并且可导致在注射部位同侧黑质神经元内形成α-syn聚集体、双侧黑质DA能神经元退行性改变以及双侧纹状体神经支配减少；行为学上，2个部位注射的大鼠模型中可见仅少数对侧前肢运动障碍。上述体内实验表明α-syn PFFs可用仅于制作啮齿类动物PD模型。随后多个研究又将α-syn PFFs分别注射到小鼠和大鼠的脑内纹状体或黑质，建立了多种基于α-syn PFFs的PD模型，并探讨了α-syn PFFs在PD模型脑内的致病作用和相关致病机制［25-29］。

根据Braak假说，PD患者的α-syn病理改变可能起源于肠道神经系统和嗅球这2个部位［30］。为了证实病理性α-syn可以从上述2个部位传播到中脑黑质部位，研究人员将α-syn PFFs分别注射到肠道肌层和嗅球，并观察病理性α-syn在相关神经通路的传播及所引起的病理改变。Kim等［31］向小鼠十二指肠和幽门肌层注射α-syn PFFs，并在注射后1、3、7和10个月分别取相关神经组织进行分析，结果显示在注射1个月后病理性α-syn可通过迷走神经扩散至大脑底部的脑干部位，3个月时继续向上扩散至蓝斑、黑质、杏仁核、下丘脑和前额叶，7个月时可蔓延到海马、纹状体和嗅球，而在迷走神经切断的小鼠或α-syn敲除的小鼠体内注射α-syn PFFs，病理性α-syn的传播可被阻断，说明病理性α-syn是通过迷走神经从肠道神经系统向脑内传播，并依赖内源性α-syn；该研究还发现注射α-synPFFs 7个月后小鼠产生精细行为障碍和焦虑样行为表现；因此研究结果显示该模型可作为一种新的PD模型用于PD的发病机制和治疗研究。此外，有研究证实脑内病理性α-syn同样会通过迷走神经传播到肠道神经系统，并引起病理性α-syn聚集和肠道神经元损伤［32］，提示病理性α-syn能通过迷走神经在脑与肠道之间互相传递。另有研究者将α-syn PFFs注射到小鼠嗅球部位，几个月后可见由该外源性α-syn PFFs诱导的内源性α-syn在远离注射部位的不同脑区产生病理性聚集，并且这种病理性聚集可导致进行性嗅觉功能缺失，这与临床上PD患者早期症状相似，因此该模型可作为前驱期PD模型用于PD早期治疗方法的研究［33-34］。

3.2 NHPs模型 为了进一步研究α-syn PFFs在NHPs动物模型中的致病作用，Shimozawa等［35］首次将α-syn PFFs注射到青年狨猴纹状体内，注射3个月后即可在多个脑区神经元内观察到磷酸化α-syn阳性染色包涵体形成，表明注射外源性α-syn PFFs可诱导内源性α-syn发生病理性聚集，并且在注射侧黑质内能观察到TH阳性神经元数量明显减少以及神经元内LBs样包涵体形成；此外，该研究发现从注射部位到新皮质、黑质、杏仁核、苍白球和丘脑等脑区均观察到病理性α-syn聚集，说明病理性α-syn可在神经元间进行逆行传播；同时，他们还观察到含有α-syn包涵体的神经元可能通过小胶质细胞的吞噬作用被清除。Chu等［36］在8只食蟹猴的壳核内注射了α-syn PFFs，12~15个月后，免疫组化染色结果显示在壳核注射区域可见大量磷酸化α-syn阳性染色的神经元，在注射部位同侧的黑质神经元内可见各种形状的磷酸化α-syn阳性染色聚集体，其中包括LBs样包涵体，同时DA能神经元数量明显减少，该研究再次证实了α-syn PFFs能够诱导NHPs产生类PD样的病理改变。但是，在上述2项研究中，模型猴均未出现明显的行为学改变，这可能与α-syn PFFs的注射剂量不足和观测周期尚短有关。

4 小结

近20年来研究人员已建立了多种基于α-syn的PD动物模型，虽然目前还没有一种模型能够完全复制PD的所有临床症状和病理改变，但每种模型均能复制PD的部分疾病特征，因此应根据不同实验目的来选用相应的动物模型。如利用rAAV作为载体在黑质部位过表达α-syn的动物模型，可用于探索αsyn的致病作用和相关机制，而α-syn PFF体内注射模型适用于病理性α-syn体内传播机制和阻断治疗的研究。因此，α-syn作为LBs的主要成分，在PD的发病中起着重要作用，其或可成为新的PD诊断生物标志物和治疗靶点。