Klotho蛋白对肾缺血再灌注大鼠急性肾损伤及纤维化的保护作用

刘竹枫　王文红　范树颖　刘艳　刘涛　王欣　吴瑕

摘要：目的 探讨Klotho蛋白在缺血再灌注（I/R）大鼠引起的急性肾损伤及纤维化进程中的作用。方法 60只健康雄性SD大鼠按随机数字表法分为假手术组（Sham组）、肾脏缺血再灌注组（I/R组）和Klotho蛋白干预组（I/R+Kl组），每组20只。I/R组采用夹闭右侧肾蒂40 min再灌注法建立肾缺血再灌注急性肾损伤模型。Sham组游离出右侧肾动脉，但不夹闭右侧肾蒂，暴露40 min后缝合腹腔。I/R+Kl组手术方法同I/R组，造模成功后，腹腔注射Klotho蛋白（0.01 mg/kg）。3组分别于造模成功后第1、7、14、28天收集大鼠血、肾组织标本，分别检测大鼠血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平；HE染色观察肾组织损伤情况，Masson染色观察肾纤维化情况，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清及肾组织Klotho蛋白水平，Western blot法检测肾脏组织Klotho蛋白的表达。结果 与Sham组比较，I/R组及I/R+Kl组血Scr及BUN水平均升高（P＜0.05），与I/R+Kl组比较，I/R组各时间点血Scr及BUN水平均升高（P＜0.05）。HE染色结果显示，第1天时I/R组肾小管出现广泛急性坏死，I/R+Kl组损伤较轻微。Masson染色结果显示，I/R组第14天出现了轻度的纤维化，第28天时纤维化程度更为显着，I/R+Kl组纤维化程度较轻微（P＜0.05）。ELISA结果显示，第1、14、28天时与Sham组比较，I/R+Kl组及I/R组血清及肾组织Klotho水平下降（P＜0.05），I/R组血清及肾组织Klotho水平均低于I/R+Kl组（P＜0.05）。Western blot结果显示，与Sham组比较，各时间点I/R组及I/R+Kl组Klotho水平均下降，而I/R+Kl组Klotho水平均高于I/R组（P＜0.05）。结论 肾缺血再灌注肾损伤时Klotho表达下调；外源性补充Klotho蛋白可缓解缺血再灌注肾损伤大鼠的急性肾损伤及纤维化，起到肾保护作用。

关键词：急性肾损伤；再灌注损伤；纤维化；肾疾病；Klotho蛋白

中图分类号：R726.92文献标志码：ADOI：10.11958/20221063

Protective effect of Klotho protein on acute renal injury and fibrosis in

rats with ischemia-reperfusion

LIU Zhufeng， WANG Wenhong FAN Shuying， LIU Yan， LIU Tao， WANG Xin， WU Xia

Department of Nephrology， Tianjin Childrens Hospital， Tianjin University Children′s Hospital， Tianjin 300134， China

Corresponding Author E-mail： docwwh@163.com

Abstract： Objective To investigate the role of Klotho protein in acute renal injury and fibrosis induced by ischemia-reperfusion （I/R） in rats. Methods Sixty healthy SD rats were randomly divided into the sham operation group （sham group）， the renal ischemia-reperfusion group （I/R group） and the Klotho protein intervention group （I/R+Kl group）， with 20 rats in each group. In the I/R group， the acute renal injury model of I/R was established by clamping the right renal pedicle for 40 min. In the sham group， the right renal artery was dissociated， but the right renal pedicle was not clamped. After exposure for 40 minutes， the abdominal cavity was sutured. The operation method of the I/R+Kl group was the same as that of the I/R group. Kiotho protein （0.01 mg/kg） was injected intraperitoneally. The blood and renal tissue samples were collected on the 1st， 7th， 14th and 28th days after successful modeling in the three groups， and blood creatinine （Scr） and blood urea nitrogen （BUN） were measured respectively. HE staining was used to observe the damage of renal tissue. Masson staining was used to observe the renal fibrosis. ELISA was used to detect levels of Klotho protein in blood and renal tissue. Western blot assay was used to detect the expression of Klotho protein in renal tissue. Results Compared with the sham group， levels of SCR and BUN were increased in the I/R group and the I/R+Kl group （P＜0.05）. Compared with the I/R+Kl group， serum levels of SCR and BUN were increased in different time points in the I/R group （P＜0.05）. HE staining showed extensive acute necrosis of renal tubules in the I/R group， and the injury was mild in the I/R+Kl group. Masson staining showed that mild fibrosis occurred in the I/R group on the 14th day， and the degree of fibrosis was more significant on the 28th day， while the degree of fibrosis was very mild in the I/R+Kl group （P < 0.05）. ELISA results showed that compared with the Sham group at day 1， 14 and 28， levels of Klotho in blood and renal tissue decreased significantly in the I/R+Kl group and the I/R group， and the level of Klotho decreased in the I/R group than that of the I/R+Kl group （P＜0.05）. Western blot results showed that compared with the Sham group， Klotho levels were decreased at all time points in the I/R group and the I/R+Kl group. while Klotho levels were higher in the I/R+Kl group than those in the I/R group （P＜0.05）. Conclusion Klotho expression is down-regulated during renal I/R injury. Exogenous supplementation of Klotho protein can alleviate acute renal injury and fibrosis in rats with renal I/R injury and play a role in renal protection.

Key words： acute kidney injury; reperfusion injury; fibrosis; kidney diseases; Klotho protein

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是由多种病因引起的肾功能快速下降而出现的复杂临床综合征。AKI后即使肾功能完全恢复，也可能造成慢性肾损害，导致慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）［1］。AKI早期可造成严重的肾小管损伤、细胞凋亡和炎性细胞浸润，进而引起永久性的肾纤维化［2］。而肾纤维化是所有肾脏损伤后导致CKD的共同途径。解决此问题的关键在于早期识别急性肾损伤后肾纤维化进展至慢性肾脏病风险的患者，从而避免AKI向CKD转化。研究发现，AKI大鼠血清及肾组织Klotho蛋白水平会随着肾功能的恶化而降低，随着肾功能的恢复而升高［3］。AKI和CKD患者肾活检结果均证实Klotho蛋白的表达水平与肾脏损伤程度相关，被认为是AKI及肾纤维化的标志物之一［4］。因此，Klotho蛋白表达水平有可能作为AKI及CKD患者预后评估的一个新型标志物。本研究设计构建了肾缺血再灌注后AKI大鼠模型，探讨Klotho蛋白在AKI向肾纤维化进展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 60只SPF级8～12周龄健康雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0008。动物房湿度50%～55%，温度20～25 ℃，动物分笼规范饲料喂养，自由进水。动物实验方案经天津市儿童医院医学伦理委员会和动物管理及使用委员会批准（批件号：KY2020-34）。

1.1.2 主要试剂及仪器 人重组Klotho蛋白（美国PeproTech公司，100-53-20UG）；兔抗Klotho蛋白一抗（Bioss，bs-2925R）；山羊抗兔IgG二抗（ZB-2301），羊抗鼠IgG二抗（ZB-2305）及抗β-actin（北京中杉金桥生物技术有限公司，TA-09）。大鼠Klotho抗体酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，CSB-E14958r）。

1.2 研究方法

1.2.1 动物分组及模型制备 大鼠按随机数字表法分为假手术组（Sham组）、肾脏缺血再灌注组（I/R组）和Klotho蛋白干预组（I/R+Kl组），每组20只。各组大鼠分别于术后第1、7、14、28天处死5只大鼠进行后续实验。采用切除一侧肾脏，夹闭对侧肾蒂法建立肾缺血再灌注后AKI模型：I/R组用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，消毒铺巾，用剪刀和镊子沿着大鼠腹部正中做一约1.5 cm纵行切口，打开皮肤和肌肉层，游离出左侧肾动脉，用手术线环绕并将其结扎，切除左侧肾脏。同样方式游离出右侧肾动脉，用动脉夹将肾蒂夹闭，40 min后松开动脉夹，恢复右侧肾脏血液灌流，观察1 min，肉眼见肾脏由暗红色逐渐变为鲜红色，表明再灌注成功，缝合腹腔，观察大鼠生命体征，同时补充饮水与饲料。Sham组切除左侧肾脏，并游离出右侧肾动脉，但不夹闭右侧肾蒂，暴露40 min后缝合腹腔。I/R+Kl组：手术方法同I/R组，造模成功后，腹腔注射Klotho蛋白（0.01 mg/kg）。3组分别于造模成功后第1、7、14、28天采血并处死大鼠，每组各时间点分别随机抽取3只大鼠，剥离肾脏，记录肾脏肉眼外观，然后用剪刀将肾脏组织剪成小块（约1 cm3），各取1块组织置于4%的中性甲醛中4 ℃固定过夜，其余组织于-80 ℃保存备用。

1.2.2 肾功能检测 腹主动脉采血，4 000 r/min离心10 min，取上清液分别用肌氨酸氧化酶法及紫外-谷氨酸脱氢酶法检测大鼠血肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）。

1.2.3 肾脏组织形态学及纤维化检查 肾组织经4%中性甲醛固定，乙醇脱水、石蜡包埋、切片（厚度为5 μm）后，HE染色观察肾组织病理损伤情况，Masson染色观察肾纤维化情况。由病理医生根据盲法原则在400倍光镜下随机观察HE染色的组织皮髓交界处10个不重叠视野，以肾小管上皮变性、肾小管管腔扩张、肾小管坏死、炎性细胞浸润、肾间质水肿和肾间质纤维化的面积作为评价肾小管和肾间质损伤指标，进行半定量分析。评分标准：病变面积＜25%为1分；25%～50%为2分；＞50%～75%为3分；＞75%为4分。计算其平均值，评分越高表明肾小管间质损伤程度越重。

1.2.4 ELISA检测大鼠血清及肾组织Klotho蛋白水平 收集大鼠血液及新鲜冰冻肾组织匀浆经3 000 r/min，离心10 min后取上清液，采用ELISA法严格按试剂盒说明检测3组大鼠各时间点的血清及肾组织Klotho蛋白水平。

1.2.5 Western blot法检测肾组织Klotho蛋白表达水平 取新鲜冰冻组织，蛋白匀浆后用Bradford法测定蛋白浓度。取总蛋白50 μg进行上样电泳，转到硝酸纤维素滤膜上，经漂洗、封闭后加入稀释一抗Klotho（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，然后加入相应二抗（1∶5 000）37 ℃孵育1 h，使用凝胶成像仪进行观察，随后用Image J软件测定蛋白灰度值，以目的蛋白与内参β-actin的灰度值比值表示。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行数据分析。所有数据以均数±标准差（x±s）表示，3组间比较用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肾功能的变化 与Sham组比较，各时间点I/R组及I/R+Kl组血Scr及BUN水平明显升高，I/R组各时间点血Scr及BUN水平均高于I/R+Kl组（P＜0.05）。见图1、2。

2.2 各组大鼠肾脏病理改变 HE染色结果显示，Sham组各时间段肾小球形态结构无明显异常、肾小管间质上皮细胞形态清晰，基底膜结构完整。第1天时I/R组可见部分肾小球坏死，肾小管大面积急性坏死，炎性细胞浸润，渗出，出血改变最显着。I/R+Kl组肾小球未见明显异常，肾小管间质可见渗出、出血，程度较I/R组轻，见图3。第7天两组的肾小管间质出血渗出较前明显减轻。Masson染色结果显示，与Sham组相比，I/R组第14天出现了轻度的纤维化，第28天时纤维化程度加重，I/R+Kl组纤维化程度较I/R组减轻（P＜0.05），见图4、5。

2.3 各组大鼠血清及肾组织Klotho表达 I/R+Kl组及I/R组第1、14、28天血清及肾组织Klotho水平较Sham组下降，I/R组血清及肾组织Klotho水平较I/R+Kl组下降；第7天，肾Klotho水平3组间差异无统计学意义（P＞0.05），血清Klotho水平I/R组较Sham组降低，I/R+Kl组较I/R组升高（P＜0.05），I/R+Kl组与Sham组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图6、7。

2.4 各组大鼠肾组织Klotho蛋白的表达 与Sham组比较，各时间点I/R组及I/R+Kl组Klotho水平均下降（P＜0.05），而I/R+Kl组Klotho水平均高于I/R组（P＜0.05），见图8。

3 讨论

本研究以I/R大鼠作为AKI动物模型来观察Klotho蛋白对AKI及AKI后肾纤维化的作用。结果显示，I/R组各时间点血Scr及BUN水平较Sham组明显升高，第1天达高峰，提示缺血再灌注以后出现AKI；第7天肾功能水平较前明显下降；第14、28天血Scr及BUN水平再次升高，HE及Masson染色下第14天肾小管水肿扩张伴轻度间质纤维化；第28天肾小管间质纤维化更为明显，提示AKI向CKD转变，证实造模成功。

肾缺血再灌注损伤是临床上最常见的AKI病因之一。因肾脏有较强的代偿功能，轻度短暂的急性肾脏缺血引起的肾功能下降往往可逆，但肾脏长时间缺血缺氧不能及时纠正、修复能力受损可导致进行性肾纤维化及CKD。AKI后进展为CKD的风险显着上升，肾缺血再灌注损伤后出现肾纤维化是引起CKD的重要原因［5］。AKI进展至CKD是多种细胞参与多种分子信号通路调控的复杂致病过程，目前尚没有抑制AKI向CKD进展的特异性治疗手段。因此，开发能够延缓或防治AKI后纤维化和保护残存肾功能的靶向干预治疗措施是防治CKD的关键［6］。

Klotho蛋白是Klotho基因编码的一种单向跨膜蛋白，高表达于正常肾小管上皮细胞，具有多种生物学效应，包括细胞保护、抗炎症反应、抗氧化应激及抗纤维化等。I/R诱导的AKI动物模型研究显示，Klotho在肾组织、血清及尿液的水平明显下降，随着肾功能的恢复，Klotho的表达也逐渐恢复［7］。AKI患者的研究也显示肾组织中Klotho的表达减少，其减少的程度与血肌酐呈正相关［8］。研究显示，CKD患者Klotho表达下调，并且肾功能越差，Klotho减少越明显［9］。因此，AKI时血浆中的Klotho水平有望作为肾实质损伤的生物标志物，在CKD中，Klotho水平也可能是早期疾病的指标，并预测进展速度［10］。

本研究结果表明，I/R诱导的AKI大鼠血清、肾组织Klotho蛋白的水平在AKI第1天明显下降，之后随着肾功能的恢复其表达也逐渐恢复，第28天时肾纤维化加重，AKI向CKD转化，Klotho蛋白水平再次下降，和既往的研究［3］一致。由此可以看出，肾及血清Klotho水平与肾功能有关，AKI时Klotho蛋白的表达为动态且可逆的。Klotho蛋白下降会加剧肾脏损伤，恢复可减轻肾脏损伤，提示Klotho蛋白可能参与了AKI发生发展的病理生理过程。因此，Klotho蛋白有望作为监测肾功能水平的生物学标志物，还可成为潜在的肾脏保护因子。

缺血再灌注向慢性肾脏病进展的主要原因是肾间质纤维化［11］。目前的实验数据证实Klotho缺陷小鼠存在更严重的肾脏损伤和纤维化以及更高的AKI到CKD转变的风险，这表明Klotho缺乏使肾脏更容易受到急性损伤［9］。在环孢素肾病［12］、阿霉素肾病［13］、单侧输尿管梗阻［14］等多种纤维化动物模型的研究中证实Klotho基因缺陷或Klotho蛋白表达下调可加重肾纤维化的进展，导致蛋白尿及肾功能水平的下降。章炜等［15］研究表明，外源性Klotho蛋白可能通过抑制细胞凋亡及炎性细胞浸润等途径改善肾脏功能、缓解肾脏病理损害、改善纤维化程度，发挥肾脏保护作用。本研究中，补充外源性Klotho蛋白后，该组各时间点的肾功能水平较于I/R组好转明显，血及肾组织Klotho蛋白水平表达明显上调，Masson染色显示纤维化程度明显减轻，提示外源性补充Klotho蛋白可减轻AKI后的纤维化程度，减缓CKD进展，证实了Klotho蛋白对肾脏的保护作用。

综上所述，I/R所致的AKI可导致严重的肾小管损伤，远期可出现肾间质纤维化，使AKI向CKD转化。AKI时Klotho蛋白表达下调；Klotho蛋白可能参与了AKI发生发展的病理生理过程，Klotho蛋白有望作为监测肾功能水平动态变化的生物学标志物。AKI后外源性补充Klotho蛋白能够改善AKI后大鼠的肾功能、延缓肾脏病理损伤及肾脏维化的进程，Klotho蛋白有望成为今后预防AKI向CKD进展的新干预靶点之一;而基于Klotho蛋白在AKI向CKD进展的机制进行转化医学的相关研究是后期的研究方向。

参考文献

［1］ HILL N R，FATOBA S T，OKE J L，et al. Global prevalence of chronic kidney disease - A systematic review and Meta-analysis［J］. PLoS One，2016，11（7）：e0158765. doi：10.1371/journal.pone.0158765.

［2］ DONG Y，ZHANG Q，WEN J，et al. Ischemic duration and frequency determines AKI-to-CKD progression monitored by dynamic changes of tubular biomarkers in IRI mice［J］. Front Physiol，2019，10：153. doi：10.3389/fphys.2019.00153.

［3］ 张菁菁，曹新岭，王顺. Klotho蛋白在缺血再灌注急性肾损伤中的动态变化［J］. 中国血液净化，2021，20（4）：258-262. ZHANG J J，CAO X L，WANG S. Dynamic changes of Klotho protein in ischemia- reperfusion of acute kidney injury patients［J］. Chin J Blood Purif，2021，20（4）：258-262. doi：10.3969/j.issn.1671-4091.2021.04.010.

［4］ BLACK L M，LEVER J M，TRAYLOR A M，et al. Divergent effects of AKI to CKD models on inflammation and fibrosis［J］. Am J Physiol Renal Physiol，2018，315（4）：F1107-F1118. doi：10.1152/ajprenal.00179.2018.

［5］ VENKATACHALAM M A，WEINBERG J M，KRIZ W，et al. Failed tubule recovery， AKI-CKD transition， and kidney disease progression［J］. J Am Soc Nephrol，2015，26（8）：1765-1776. doi：10.1681/ASN.2015010006.

［6］ HU M C，SHI M，ZHANG J，et al. Klotho deficiency is an early biomarker of renal ischemia-reperfusion injury and its replacement is protective［J］. Kidney Int，2010，78（12）：1240-1251. doi：10.1038/ki.2010.328.

［7］ SEO M Y，YANG J，LEE J Y，et al. Renal Klotho expression in patients with acute kidney injury is associated with the severity of the injury［J］. Korean J Intern Med，2015，30（4）：489-495. doi：10.3904/kjim.2015.30.4.489.

［8］ HU M C，KURO-O M，MOE O W. Klotho and chronic kidney disease［J］. Contrib Nephrol，2013，180：47-63. doi：10.1159/000346778.

［9］ RAY S K，MASARKAR N，MUKHERJEE S. Implications of Klotho protein for managing kidney disease-an emerging role in therapeutics and molecular medicine［J］. Curr Mol Med，2021，21（6）：484-494. doi：10.2174/1566524020666201120143313.

［10］ NEYRA J A，HU M C，MOE O W. Klotho in clinical nephrology：Diagnostic and therapeutic implications［J］. Clin J Am Soc Nephrol，2020，16（1）：162-176. doi：10.2215/CJN.02840320.

［11］ 谢志勇，李锐钊，梁馨苓. 急性肾损伤进展至慢性肾脏病的机制研究进展［J］. 中华肾脏病杂志，2020，36（9）：731-736. XIE Z Y，LI R Z，LIANG X L. Research progress in the pathogenesis of acute renal injury to chronic kidney disease［J］. Chin J Nephrol，2020，36（9）：731-736. doi：10.3760/cma.j.cn441217-20200109-00130.

［12］ LIU Q F，YE J M，YU L X，et al. Klotho mitigates cyclosporine A （CsA）-induced epithelial-mesenchymal transition （EMT） and renal fibrosis in rats［J］. Int Urol Nephrol，2017，49（2）：345-352. doi：10.1007/s11255-016-1439-0.

［13］ TAKENAKA T，INOUE T，MIYAZAKI T，et al. Klotho suppresses the renin-angiotensin system in adriamycin nephropathy［J］. Nephrol Dial Transplant，2017，32（5）：791-800. doi：10.1093/ndt/gfw340.

［14］ YIN S，ZHANG Q，YANG J，et al. TGFβ-incurred epigenetic aberrations of miRNA and DNA methyltransferase suppress Klotho and potentiate renal fibrosis［J］. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res，2017，1864（7）：1207-1216. doi：10.1016/j.bbamcr.2017.03.002.

［15］ 章炜，王鸣，费晓，等. Klotho对缺血再灌注急性肾损伤的影响研究［J］. 浙江医学，2020，42（20）：2175-2184. ZHANG W，WANG M，FEI X，et al. Effects of Klotho on acute kidney injury induced by ischemia reperfusion［J］. Zhejiang Med J，2020，42（20）：2175-2184. doi：10.12056/j.issn.1006-2785.2020.42.20.2020-1755.

（2022-07-05收稿 2022-11-25修回）

（本文编辑 魏杰）