胎盘中血管内皮生长因子及其受体1改变与子痫前期的相关性研究

张彩 游泽山 李理 李晓明

临床研究论着

胎盘中血管内皮生长因子及其受体1改变与子痫前期的相关性研究

张彩 游泽山 李理 李晓明

目的探讨胎盘中血管内皮生长因子(VEGF)及其可溶性受体1(sFlt-1)的变化与妊娠期高血压疾病的关系。方法采用半定量逆转录PCR法和免疫组织化学染色法检测20例正常人工流产绒毛组织、40例正常妊娠晚期、40例轻度子痫前期及40例重度子痫前期孕妇胎盘组织中VEGF及sFlt-1的表达及胎盘微血管密度(MVD)。结果子痫前期和正常妊娠孕妇绒毛或胎盘中均有VEGF、sFlt-1 mRNA和蛋白的表达。正常妊娠早期组、正常妊娠晚期组、轻度子痫前期组及重度子痫前期组VEGF、sFlt mRNA及蛋白表达水平两两比较差异均具有统计学意义(P均<0.01)。随着妊娠的进展，胎盘MVD逐渐增加，而在子痫前期孕妇中逐渐减少，组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.01)。轻、中度子痫前期胎盘组织中VEGF与sFlt-1 mRNA和蛋白表达水平均呈负相关(P均<0.05)。各组绒毛或胎盘组织中MVD与VEGF mRNA和蛋白表达水平均呈正相关(P均<0.05)，而与sFlt-1 mRNA和蛋白质表达呈负相关(P均<0.05)。结论VEGF和sFlt-1参与妊娠期高血压疾病的发生、发展，VEGF和sFlt-1在妊娠期高血压疾病的发病过程中可能存在着相反的关系，也就是VEGF对妊娠期高血压疾病的发生具有保护作用而sFlt-1则对其具有促进作用。

血管内皮生长因子；可溶性血管内皮生长因子受体-1；子痫前期

妊娠期高血压疾病是妊娠期特有的疾病，是造成孕产妇死亡的重要原因之一，也是产科病理的研究重点之一[1]。血管内皮细胞损伤是其发病的重要环节，但造成血管内皮细胞损伤的原因尚不清楚。可溶性血管内皮生长因子受体1(sFlt-1)由Flt-1在胞外被剪接而成，缺少跨膜区和胞质区，但保留了与血管内皮生长因子(VEGF)高亲和力的特性，与Flt-1和含激酶插入区受体形成异源二聚体，最终阻断VEGF的生物学活性[2]。本研究旨在通过对妊娠期高血压疾病孕妇胎盘组织中VEGF和sFlt-1水平进行定量分析，进一步探讨其与妊娠期高血压疾病发生的作用及两者间关系。

对象与方法

一、研究对象

2010年1月至2011年10月在我院诊断为轻度子痫前期(40例)、重度子痫前期(40例)单胎孕妇和40名与之年龄、孕周相匹配的无妊娠合并症的正常妊娠晚期孕妇。妊娠期高血压疾病的诊断及分类标准参照全国高等学校教材《妇产科学》第7版[3]。同时收集妊娠早期人工流产绒毛组织20例。重度子痫前期孕妇40例，孕(37±3)周；轻度子痫前期孕妇40例，孕(37±5)周。正常妊娠晚期妊娠妇女40例，均为孕37～38周无子宫收缩入院，而行剖宫产术终止妊娠者。所有孕妇均无高血压病及心脏病史，无慢性肾炎等泌尿系统疾病，无贫血及巨大儿和胎儿生长受限的发生。

二、方法

1.胎盘标本收集

待孕妇胎盘娩出后，于母面近脐带处，避开钙化点迅速取胎盘组织2～4块，每块约2 cm×2 cm×2 cm，灭菌生理盐水反复漂洗，去除母体血液后吸掉水分，迅速置于液氮中，过夜后置于-80℃冰箱保存备用。

2.总RNA的提取

取保存的胎盘组织150 mg放入预冷的10 mm×15 mm试管中，加入Trizol总RNA抽提试剂1 ml用电动匀浆器冰浴下粉碎组织成匀浆，按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA，紫外分光光度计测定吸光度A值，1%琼脂糖凝胶电泳可见28 S、18 S条带，表明RNA质量符合要求，可用于逆转录。

3.RNA逆转录及目的基因片段的扩增

将所有总RNA均匀稀释至0.5 g/L，按照美国Promega公司的逆转录试剂盒说明书操作，将mRNA逆转录为模板DNA。根据sFlt-1基因系列设计引物：上游引物P1为5’-GGAATTCCGCGCTCAGCATGGTCAGC-3’，下游引物P2为5’-TTGGATCCTACCGCTTGCCAGCTACGGTTT-3。用于检测VEGF mRNA的上游引物为5’ -TGCCTTGCTGCTCTACCTCC-3’，下游引物为5’-TCACCGCCTCGGCTTGTCAC-3’，以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因，上游引物为5’-CACCCTGTGCTGCTCACCGAGGCC-3’，下游引物为5’- CCACACAGATGACTTGCGCTCAGG-3’。PCR反应体系为30 μl ，条件设定为：94℃预变性4 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，共28个循环，最后72℃延伸10 min。取10 μl PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，β-actin作为内参照，测定特异条带的密度，得出目的基因mRNA的相对表达水平。

4.胎盘组织VEGF和sFlt-1蛋白表达水平的检测

采用免疫组织化学染色方法检测，按PV-6000免疫组织化学染色试剂盒说明书步骤操作，阴性对照以磷酸盐缓冲液代替一抗。阳性结果判断标准：标本组织细胞质或基质中有黄色和棕黄色颗粒。采用相关软件测定阳性细胞的平均光密度A值。每张切片随机选取8个区域的阳性细胞计算光密度，以其均值反映VEGF和sFlt-1的蛋白表达水平。

5.胎盘绒毛微血管密度(MVD)的计算

以CD34鼠抗人单克隆抗体标记胎盘内的血管，以细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性。参照Maeda等(1996年)方法在100倍光镜下挑选微血管分布最高密度区域，然后在400倍光镜下观察5个视野，计算每个视野内的微血管数目，取平均值作为MVD值。

三、统计学处理

结 果

一、各组胎盘或绒毛组织中VEGF、sFltmRNA和蛋白的表达水平比较

子痫前期组和正常妊娠组胎盘中均有VEGF、sFlt-1 mRNA和蛋白的表达。正常妊娠早期、正常妊娠晚期、轻度子痫前期及重度子痫前期组VEGF、sFlt mRNA及蛋白表达水平两两比较差异均具有统计学意义(P均<0.01)。随着妊娠的进展，胎盘MVD逐渐增加，而在子痫前期孕妇中逐渐减少，组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.01)，见表1。

二、胎盘或绒毛组织VEGF与sFlt-1mRNA和蛋白表达水平的相关性分析

轻、重度子痫前期胎盘组织中VEGF与sFlt-1 mRNA和蛋白表达水平均呈负相关(P均<0.05)，见表2。

表1 各组胎盘或绒毛组织中VEGF、sFlt-1 mRNA和蛋白质的表达水平及MVD比较

注：与妊娠早期绒毛组织比较，aP<0.01；与正常妊娠晚期胎盘组织，bP<0.01；与轻度子痫前期胎盘组织比较，cP<0.01

表2 各组绒毛或胎盘组织中VEGF与sFlt-1 mRNA和蛋白表达水平的相关性分析

三、胎盘或绒毛组织中VEGF及sFlt-1mRNA和蛋白表达水平与MVD的相关性分析

各组胎盘绒毛组织中MVD与VEGF mRNA和蛋白表达水平均呈正相关(P均<0.05)，而与sFlt-1 mRNA和蛋白质表达呈负相关(P均<0.05)。这也与正常妊娠生理需要相符合，随着孕周的增加，母胎间营养物质交换增多，血管密度也随着增加，以满足生长发育的需要。

表3 各组绒毛或胎盘MVD与VEGF及sFlt-1 mRNA和蛋白之间的相关性分析

讨 论

子痫前期的发病包括胎盘异常阶段和母体异常阶段。胎盘异常阶段以胎盘缺血、发育异常为特征，同时伴有胎盘分泌一些因子包括sFlt-1通过胎盘-血管屏障进入母体血循环，引起广泛的血管内皮损伤；母体异常则是在胎盘异常的基础上出现高血压病、蛋白尿等临床表现[4-5]。VEGF是目前公认最重要的促血管生成因子，与其受体Flt-1结合，在妊娠早期参与胎盘血管网的形成而在妊娠晚期主要调节血管内皮细胞的通透性，有利于胎儿生长发育。本研究表明，随着孕周增加胎盘组织中VEGF表达水平升高，妊娠晚期VEGF水平明显高于妊娠早期，而子痫前期孕妇中VEGF表达水平较正常妊娠晚期妇女明显降低，但仍高于妊娠早期妇女，与Chun等(2005年)的研究结果一致。

sFlt-1是VEGF跨膜受体Flt-1的可溶形式，因其缺乏跨膜区和细胞内结构域，虽能与相应配体结合但不能转录VEGF信号，从而成为VEGF拮抗剂，使循环中VEGF水平下降阻断VEGF的各种生理作用，引起血管生成障碍和内皮损伤[6-7]。本研究发现，正常妊娠和子痫前期患者胎盘组织中均有sFlt-1 mRNA和蛋白的表达，但子痫前期患者表达水平明显高于相应孕周正常妊娠妇女，且重度子痫前期患者明显高于轻度患者。Maynard等(2003年)检测了子痫前期患者胎盘Flt-1及sFlt-1的表达，发现Flt-1和sFlt-1表达均增强，结合本研究中发现子痫前期患者胎盘sFlt-1mRNA和蛋白表达明显升高,均证实了sFlt-1参与了子痫前期的病理生理过程。

胎盘sFlt-1过度表达是否为子痫前期的病因及其作用机制目前仍不明确。Hornig等(2000年)的体外实验结果表明缺氧可诱导胎盘滋养细胞sFlt-1的表达，而子痫前期患者存在胎盘缺血、缺氧，因此子痫前期患者胎盘sFlt-1过度表达可能是子痫前期的继发事件。而Hertigh等(2004年)和Mckeeman等(2005年)研究发现子痫前期患者临床症状出现前6～11周血清sFlt-1水平即有明显升高，提示胎盘sFlt-1过度表达造成血清sFlt-1水平升高，可能是子痫前期的重要原因。胎盘MVD是反映促血管生成因子VEGF水平的直接指标，缺氧时胎盘MVD应该是代偿性增加即与sFlt-1呈正相关。本研究同时检测VEGF、sFlt-1及MVD的变化并分析两者之间的相关性，MVD与VEGF表达量呈正相关也进一步证实了两者之间的直接关系，如果sFlt-1是缺氧的继发事件则子痫前期时胎盘MVD应该增加。然而，MVD与sFlt-1呈负相关，这则与之相悖，在一定程度上说明sFlt-1可能是子痫前期的重要病因，有关结论尚待通过转染诱导sFlt-1过表达或者基因沉默抑制sFlt-1表达与子痫前期发病之间个体关系予以证实。

[1]Masoura S, Kalogiannidis IA, Gitas G, Goutsioulis A, Koiou E, Athanasiadis A, Vavatsi N.Biomarkers in pre-eclampsia: a novel approach to early detection of the disease.J Obstet Gynaecol,2012,32(7):609-616.

[2]Shibuya M. Differential roles of vascular endothelial growth factor receptor-1 and receptor-2 in angiogenesis. J Biochem Mol Biol, 2006,39(5): 469-478.

[3]乐杰.妇产科学. 7版，北京：人民卫生出版社，2008：94-95.

[4]Bådescu A, Georgescu CV, Vere CC, Cråioiu S, Grigore D.Correlations between Her2 oncoprotein, VEGF expression, MVD and clinicopathological parameters in gastric cancer.Rom J Morphol Embryol, 2012,53(4):997-1005.

[5]Szpera-Gozdziewicz A, Breborowicz GH. Endothelial dysfunction in the pathogenesis of pre-eclampsia. Front Biosci (Landmark Ed), 2014,19:734-746.

[6]王马列，梁润彩. VEGF、sFlt-1与双绒毛双胎体质量不同一性的相关性研究. 新医学，2012，43(1)：42-45.

[7]Rajakumar A, Powers RW, Hubel CA, Shibata E, von Versen-Höynck F, Plymire D, Jeyabalan A.Novel soluble Flt-1 isoforms in plasma and cultured placental explants from normotensive pregnant and preeclamptic women. Placenta,2009,30(1):25-34.

Correlationbetweenthechangesofplacentalvascularendothelialgrowthfactorandreceptor1andpreeclampsia

ZhangCai,YouZeshan,LiLi,LiXiaoming.

DepartmentofObstetricsandGynecology,theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou511700,China

,YouZeshan,E-mail:youzeshan888@21cn.com

ObjectiveTo investigate the relationship between the alterations in placental vascular endothelial growth factor (VEGF) and soluble receptor 1 (sFlt-1) and hypertension during gestation period.MethodsThe expression of VEGF and sFlt-1 and microvascular density (MVD) in the villi of twenty healthy women with normal induced abortion and the placental tissues of 40 with late pregnancy, 40 with mild preeclampsia and 40 with severe preeclampsia were measured using semi-quantitative reverse transcription PCR and immunohistochemical staining.ResultsAt both protein and mRNA levels, VEGF and sFlt-1 were expressed in the villi or placenta from healthy pregnant women and those with preeclampsia. The expression of VEGF and sFlt at both protein and mRNA levels significantly differed between any two groups among early and late pregnancy, mild and severe preeclampsia groups (allP<0.01). Along with the development of pregnancy, the placental MVD was gradually increased, whereas steadily decreased in pregnant women with preeclampsia with statistical significance between any two groups (allP<0.01). In the mild and moderate preeclampsia groups, the expression of placental VEGF mRNA and protein was negatively correlated with those of sFlt-1 (allP<0.05). In each group, MVD was positively correlated with expression of VEGF mRNA and protein (allP<0.05). However, MVD was negatively correlated with the expression of sFlt-1mRNA and protein (allP<0.05).ConclusionsVEGF and sFlt-1 participate in the incidence and progression of hypertension during gestation period. These two factors probably play different roles in the process. VEGF is help to prevent the incidence of gestational hypertension, whereas sFlt-1 exerts a promoting effect.

Vascular endothelial growth factor；sFlt-1；Preeclampsia

10.3969/g.issn.0253-9802.2015.08.007

广东省科技计划项目(2008B030301072)

510700 广州，中山大学附属第一医院黄埔院区妇产科

，游泽山，E-mail: youzeshan888@21cn.com

2015-02-23) (本文编辑：林燕薇)