瞬时受体电位C1对人卵巢癌细胞ES-2增殖和凋亡的影响

高蕾　郁兰芳

314300 嘉兴，浙江省海盐县人民医院妇产科(高蕾)；310003杭州，浙江大学医学院第一附属医院肿瘤内科(郁兰芳)



瞬时受体电位C1对人卵巢癌细胞ES-2增殖和凋亡的影响

高蕾郁兰芳

314300 嘉兴，浙江省海盐县人民医院妇产科(高蕾)；310003杭州，浙江大学医学院第一附属医院肿瘤内科(郁兰芳)

【摘要】目的探讨瞬时受体电位C1(TRPC1)对人卵巢癌细胞ES-2增殖和凋亡的影响。方法利用荧光定量PCR检测人卵巢癌细胞ES-2、SKOV3、OV1以及OV2和正常卵巢上皮细胞IOSE80中TRPC1的表达水平。设计并合成靶向TRPC1的特异性短发卡RNA(shRNA)，通过脂质体转染TRPC1表达最高的人卵巢癌细胞ES-2以构建稳定低表达TRPC1细胞株ES-2/shRNA，通过蛋白免疫印迹法和荧光定量PCR检测shRNA的干扰效率、MTT比色法检测干扰后细胞的增殖能力、流式细胞仪检测细胞凋亡情况、蛋白免疫印迹法检测磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、细胞周期素D1(Cyclin D1)以及B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的表达水平。结果在4种卵巢癌细胞株中，ES-2 的TRPC1表达水平最高。特异性靶向转染TRPC1 shRNA能够有效下调ES-2细胞中TRPC1表达水平；ES-2/shRNA细胞的增殖速度较转染空白载体的ES-2/Con及ES-2细胞明显减慢(P<0.01)。ES-2/shRNA细胞的凋亡率明显高于ES-2/Con及ES-2细胞(P<0.01)。TRPC1干扰组细胞的p-PI3K、Cyclin D1以及Bcl-2的蛋白表达强度比ES-2/Con及ES-2明显减弱。结论采用RNA干扰技术能够有效沉默ES-2细胞的TRPC1基因，并致使其细胞增殖能力下降以及细胞凋亡率升高，其中可能的机制为通过对细胞因子PI3K的调控影响人卵巢癌细胞的增殖和凋亡。

【关键词】瞬时受体电位C1；增殖；凋亡；卵巢癌

在女性生殖器官恶性肿瘤中，卵巢癌发病率占第3位，然而病死率一直位居首位。究其原因，大多数卵巢癌发病隐匿，约75%的患者在发现时已属于晚期。针对晚期卵巢癌，癌细胞减灭术加紫杉醇或铂类联合化学治疗，能暂时缓解疾病进展，但是肿瘤复发率却在80%以上[1-4]。因此，迫切需要寻找卵巢癌的治疗新方法。随着分子生物学的飞速发展，分子靶向治疗已成为当今卵巢癌防治研究的热点。瞬时受体电位C1(TRPC1)是瞬时受体电位通道蛋白(TRP)家族中的一员，可通过调节钙离子内流参与细胞多种生理及病理活动。既往研究表明，TRP与多种肿瘤的发生及预后密切关联[5-6]。本研究拟采用特异性靶向TRPC1的短发夹RNA(shRNA)转染卵巢癌细胞株ES-2，筛选并构建低表达TRPC1的稳定细胞株，通过对比转染空载体的对照组细胞，观察TRPC1基因表达变化对ES-2细胞增殖和凋亡的影响，初步探讨TRPC1在人卵巢癌细胞中的分子作用机制。

材料与方法

一、细胞培养

人卵巢癌细胞株ES-2、SKOV3、OV1以及OV2与正常卵巢上皮细胞株IOSE80购自中国科学院上海细胞库。5株细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培基中，并置于5%CO2以及37℃培养箱内培养。倒置显微镜下观察细胞生长情况，待细胞长至约80%用含依地酸二钠(EDTA)的胰酶消化并传代培养。取对数生长期的细胞进行实验。

二、TRPC1的特异性shRNA转染

TRPC1 shRNA购自美国Santa Cruz公司(Cat. sc-270467-SH)。采用脂质体转染技术，具体操作流程参照英韦创津公司的Lipofectamine2000产品说明书。转染48 h后加入筛选抗生素G418，浓度为400 μg/ml，维持培养6 d后，G418浓度改为200 μg/ml；细胞扩增后，提取蛋白和RNA，进行荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法鉴定。

三、TRPC1 mRNA表达水平的检测

采用荧光定量PCR法检测。稳定转染后，用Trizol提取总RNA，计算各组RNA浓度和纯度，根据试剂盒说明书进行逆转录反应：42℃反应60 min，95℃ 5 min，4℃ 5 min。荧光定量PCR：将反应管置入ABI7500系统中，设置反应条件为：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s，共45个循环。引物序列如下： TRPC1上游5’-GATGTGCTTGGGA-GAAATGC-3’，下游5’-CAAGACGAAACCTGGAATGC-3’，长度232 bp； 内参GAPDH上游5’- ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’， 下游5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，长度452 bp。该实验重复3次。

四、TRPC1蛋白表达水平的检测

采用蛋白免疫印迹法检测。TRPC1、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、细胞周期素D1(Cyclin D1)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)以及GAPDH抗体均购自美国abcam公司。提取细胞总蛋白后，采用BCA法定量计算总蛋白浓度，蛋白质凝胶电泳后转膜，室温封闭1 h，加入第一抗体(TRPC1、p-PI3K、Cyclin D1以及Bcl-2)，4℃孵育过夜，加入二抗，室温孵育1 h。采用化学发光法检测相关蛋白表达并进行灰度分析。该实验重复3次。

五、MTT比色法检测细胞增殖能力

取对数生长期的稳定转染TRPC1特异性shRNA的ES-2细胞，经胰酶消化后，对其进行细胞计数，以每孔5×103个细胞接种于96孔培养板中，ES-2/shRNA、ES-2/Con及ES-2细胞分别设置3个复孔，并设空白对照孔(不加shRNA，仅加培养基)，分别培养24、48、72 h。用MTT法检测570 nm波长处各个小孔的光密度(OD)值， 并绘制生长曲线。

六、细胞凋亡实验

ES-2/shRNA、ES-2/Con及ES-2细胞分别接种于6孔板的小孔中：弃RPMI1640培养基，使用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞，胰酶消化细胞，收集于小离心管中，低速离心5 min，弃上清液。按Annexin V-FITC/PI双染凋亡试剂盒说明书操作，完成后用流式细胞仪检测。实验重复3次。

七、统计学处理

结果

一、细胞TRPC1 mRNA表达水平

相对于正常卵巢上皮细胞IOSE80(设定为1)，4株人卵巢癌细胞(ES-2、SKOV3、OV1以及OV2细胞)的TRPC1 mRNA的相对表达量分别为5.02±0.08、3.23±0.05、1.78±0.08、2.13±0.04，见图1。因ES-2的TRPC1 mRNA表达水平最高，故选择ES-2作为研究对象进行下一步实验。

图1　TRPC1 mRNA在4株人卵巢癌细胞和1株正常卵巢上皮细胞中的表达水平

二、特异性靶向TRPC1 shRNA稳定转染ES-2细胞后TRPC1的表达

特异性靶向TRPC1稳定转染ES-2细胞后，使用PCR及蛋白免疫印迹法验证沉默效率。结果显示，转染TRPC1 shRNA的ES-2细胞(ES-2/shRNA)、转染空载体的ES-2细胞(ES-2/Con)、未转染的ES-2细胞间TRPC1 mRNA及蛋白表达水平比较差异有统计学意义(F分别为48.374、42.542，P均<0.001)；与未转染及转染空载体的ES-2细胞相比，转染TRPC1 shRNA的ES-2细胞mRNA(t分别为10.453、9.649，P均<0.01,图2B)及蛋白表达水平均明显降低(t分别为9.488、8.845，P均<0.01,图2C)。

图2　shRNA明显抑制ES-2细胞的TRPC1表达

A：蛋白免疫印迹法检测结果；B：mRNA定量结果；C：蛋白定量结果；与ES-2及ES-2/Con细胞比较，**P<0.01

三、TRPC1基因沉默对ES-2细胞增殖能力的影响

ES-2/shRNA、ES-2/Con、ES-2的增殖速度比较差异均有统计学意义(F=53.251，P<0.001)，ES-2/shRNA细胞的增殖速度比ES-2/Con及ES-2细胞明显减慢(F分别为48.857、37.413，P均<0.001)，ES-2/Con与ES-2细胞的增殖速度比较差异无统计学意义(F=0.645，P=0.481)，见图3。

图3　TRPC1对ES-2细胞体外增殖能力的影响

四、TRPC1基因沉默对ES-2细胞凋亡的影响

ES-2、ES-2/Con和ES-2/shRNA细胞的凋亡率分别为(17.2±3.4)%、(18.3±2.5)%，(34.1±4.7)%，3组细胞的凋亡率比较差异有统计学意义(F=32.220，P<0.001)。ES-2/shRNA细胞凋亡率明显高于ES-2及ES-2/Con细胞(t分别为5.046、5.141，P均<0.01)。ES-2细胞凋亡率与ES-2/Con细胞比较差异无统计学意义(t=0.451，P=0.675)，见图4。

五、TRPC1基因沉默对ES-2细胞的PI3K、Cyclin D1以及Bcl-2表达强度的影响

ES-2/shRNA细胞的Cyclin D1、Bcl-2、p-PI3K的表达均较ES-2和ES-2/Con细胞减弱,见图5。

讨论

卵巢癌是一种常见的妇科恶性肿瘤。由于卵巢癌早期缺少症状，症状缺乏特异性，筛查的作用有限，因此早期诊断比较困难， 多数患者在就诊时已为晚期，而晚期病例的疗效欠佳。因此，卵巢癌的早期诊断显得非常重要[7]。钙离子是细胞内信号传导过程中重要的第二信使，细胞内钙离子平衡的紊乱参与肿瘤细胞的多种生物学行为，如肿瘤的生长、转移、侵袭和分化,是恶性肿瘤细胞发生、发展的重要因素[8]。TRP可通过介导钙离子内流调节肿瘤细胞的生物学行为。TRPC1是一种非选择性的阳离子通道，已被证实在前列腺癌、肺癌及乳腺癌等多种恶性肿瘤中表达升高，并预示预后较差[9-12]。本研究表明，在人卵巢癌细胞中，TRPC1表达升高；通过RNA干扰法成功构建TRPC1低表达的ES-2细胞株后，发现ES-2/shRNA细胞的增殖能力较ES-2/Con和ES-2细胞下降。此外，ES-2/shRNA细胞的凋亡率比ES-2/Con和ES-2细胞升高。由此推测，TRPC1可能是卵巢癌的促癌基因。

图4　TRPC1对ES-2细胞凋亡率的影响

图5　TRPC1对ES-2细胞中PI3K、Cyclin D1以及Bcl-2表达的影响

PI3K/蛋白激酶B(AKT)信号通路已被证实和肿瘤的发生、发展密切相关。PI3K作为PI3K/AKT通路中重要的调节因子，其在肿瘤细胞增殖和凋亡过程中起着关键作用[13-14]。一方面，PI3K对Cyclin D1有着间接调节作用，其磷酸化之后可活化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)从而增加Cyclin D1 mRNA翻译，进而促进细胞增殖；另一方面，PI3K磷酸化后活化AKT能够直接磷酸化促凋亡分子BAD，而磷酸化的BAD与Bcl-2发生结聚，从而使游离的Bcl-2发挥抗凋亡作用；此外，PI3K还能通过磷酸化forkhead家族转录因子，从而抑制凋亡相关基因如Fas-L、IGFBP1和Bim的转录[15]。因此，我们推测TRPC1调控人卵巢癌细胞的增殖以及凋亡可能与PI3K/AKT通路相关。

为了验证以上猜测，本研究检测了人卵巢癌细胞ES-2细胞在TRPC1下调后，p-PI3K、CyclinD1以及Bcl-2的表达水平均比2个对照组明显下降。提示了TRPC1调节人卵巢癌细胞的恶性行为的部分机制可能是通过对PI3K/AKT信号通路的调控，从而调节增殖以及凋亡相关因子的表达水平。然而值得注意的是，肿瘤发生、发展与多条信号通路相关，且这些信号通路之间可能还存在着交叉作用，下一步我们将对TRPC1在卵巢癌中的分子机制进行更全面及深入的研究。

综上所述，本研究探讨了TRPC1对人卵巢癌细胞增殖及凋亡的影响，发现TRPC1可通过活化PI3K等因子促进肿瘤细胞的增殖及抑制其凋亡。这为进一步揭示TRPC1基因与卵巢癌的关系提供新的实验依据，更为进一步探索卵巢癌发生、发展的分子机制提供了新的思路。

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(本文编辑：林燕薇)

Effect of TRPC1 on proliferation and apoptosis of human ovarian carcinoma cell ES-2

GaoLei,YuLanfang.

DepartmentofGynaecology&Obstetrics,HaiyanPeople’sHospital,Jiaxing314300,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of transient receptor potential channel 1 (TRPC1) upon the proliferation and apoptosis of human ovarian carcinoma cell ES-2. MethodsThe expression levels of TRPC1 in human ovarian carcinoma cell ES-2, SKOV3, OV1 and OV2, and normal human ovarian epithelial cell ISOE80 were detected by fluorescent quantitative PCR. Specific short hairpin RNA (shRNA) targeting TRPC1 was designed, synthesized, and then transfected into the ES-2 cells with the highest expression of TRPC1 via liposome to construct ES-2/shRNA cell line stably and lowly expressing TRPC1. The interfering efficiency of shRNA was validated by western blot and fluorescent quantitative PCR. The proliferation and apoptosis of ES-2 were detected by using MTT assay and flow cytometry. The expression levels of phosphatidylinositol 3-kinase (p-PI3K), Cyclin D1 and B-cell lymphoma (Bcl-2) were measured by western blot. ResultsAmong four human ovarian carcinoma cell lines, ES-2 expressed the highest level of TRPC1. TRPC1-targeted shRNA could effectively down-regulate the expression level of TRPC1 in ES-2 cells. Compared with those of ES-2/Con and ES-2, the proliferation rate of ES-2/shRNA was significantly lower (P<0.01) whereas the apoptosis rate was considerably higher(P<0.01). The expression levels of p-PI3K, Cyclin D1 and Bcl-2 in the shRNA interference group were significantly down-regulated compared with those in the ES-2/Con and ES-2 cells. ConclusionsRNA interference technique can effectively silence the TRPC1 in ES-2 cells, decrease cell proliferation ability and enhance cell apoptosis, probably by regulating cytokine PI3K to affect the proliferation and apoptosis of human ovarian carcinoma cells.

【Key words】Transient receptor potential channel 1; Proliferation; Apoptosis; Ovarian carcinoma

(收稿日期：2015-08-02)

Corresponding author, Yu Lanfang

通讯作者，郁兰芳

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.02.008

·基础研究论着·