张丽娟， 高晓明
(苏州大学 生物医学研究院， 江苏 苏州 215123)
钙网蛋白片段cDNA克隆、蛋白表达及免疫学活性研究*
张丽娟， 高晓明*
(苏州大学 生物医学研究院， 江苏 苏州 215123)
目的： 研究钙网蛋白(CRT)发挥免疫生物学活性的主要功能区域。方法： 采用PCR法从CRT基因cDNA全长中扩增第150-230位编码氨基酸所对应的核苷酸序列片段，利用分子生物学方法构建原核重组表达质粒，采用大肠杆菌表达系统进行原核表达；通过亲和纯化得到目的蛋白，分析目的蛋白特性；并通过体内、体外实验对蛋白的免疫学活性进行分析。结果： 成功构建了表达CRT150-230片段(rCRT/150-230)的原核表达质粒，并从细菌裂解液上清中纯化得到目的蛋白，蛋白单体通过分子间二硫键形成二聚体，天然状态下形成多聚体；体外研究表明rCRT/150-230促进小鼠脾细胞的分裂，活化巨噬细胞产生一氧化氮(NO)，诱导人外周血单个核细胞产生TNF-α；体内研究表明，rCRT/150-230刺激小鼠产生高滴度抗体，该特异性抗体能识别rCRT/150-230与rCRT。结论： rCRT/150-230蛋白具有与rCRT相似的免疫活性，因此推测该蛋白片段是全长CRT发挥免疫学活性的区域。
免疫学； 钙网蛋白； 蛋白片段； 生物学活性
钙网蛋白(calreticulin，CRT)是一个维持机体Ca2+稳态的钙连蛋白，CRT存在于多种生物体中，包括脊椎动物、无脊椎动物乃至高等植物[1-3]。CRT的分子量为46 kDa，由N-domain、P-domain和C-domain[4-6]3个结构域组成。CRT属于多功能蛋白，参与了细胞中多种生物学过程，如分子伴侣、Ca2+平衡、细胞黏附、基因表达、凋亡细胞清除、抗肿瘤免疫应答等。由于CRT特殊的结构组成，研究人员对其中一些结构域或片段进行了功能研究[7-10]，但关于CRT免疫学活性的研究并未见报道。本课题组其他研究人员已经证明了CRT中存在一段高保守性片段39-272片段，在CRT中发挥免疫调节作用[11]。为了找到CRT发挥免疫调节功能更为核心的区域，本研究利用分子生物学实验技术从CRT基因cDNA全长中扩增出从150-230位编码氨基酸所对应的核苷酸序列片段(CRT/150-230)，并对该蛋白的免疫生物学活性进行了分析。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 菌株E.coliDH5α与E.coliBL21(DE3)来源于天根生化公司，质粒pGEM-T来源于Promega，质粒pET28a、pET28a-CRT为本室保存。
1.1.2 细胞 脾细胞取自6～8周龄的雌性BALB/c小鼠，体重约18～20 g；腹腔巨噬细胞来源于硫代乙醇酸钠(3%)处理3 d后的雌性C57BL/6小鼠，每只注射体积2 mL， 6～8周龄，体重18～20 g。实验动物均由上海斯莱克动物有限公司提供。
1.1.3 酶与主要试剂 限制性内切酶、T4 DNA连接酶、T4 DNA聚合酶来源于Promega公司，质粒抽提试剂盒、DNA回收试剂盒来源于AXYGEN公司，Ni-NTA凝胶购自Novagen公司，PCR引物来源于Invitrogen公司合成。
1.2 方法
1.2.1 原核表达质粒构建 以pET28a-CRT质粒为模板，以P1(5′CGGATCCTACAAGGGCAAGAATGTGCTGAT3′)、P2(5′CCCAAGCTTCTAATCTGTGGGGTCATCGATCTTG3′)为引物通过PCR扩增CRT片段150～230序列，将片段连接至pGEM-T Vector，转化至克隆菌DH5α中，从正确的克隆菌中抽提质粒进行酶切，将酶切出的目的片段连接至pET28a质粒中，转化至克隆菌DH5α中，鉴定正确后，抽提质粒转化至表达菌BL21中。
1.2.2 rCRT/150-230蛋白表达 将携带目的基因序列的重组质粒转化至BL21感受态中，从卡那霉素(Kana,100 mg/L)琼脂糖平板上筛选阳性克隆，挑取平板上单克隆接种于Kana培养基LB中，37 ℃培养6～8 h，转接一次新鲜的LB，37 ℃培养至OD600为0.6～0.8，以终浓度0.1 mmol/L的IPTG为诱导条件，培养5 h即可。
1.2.3 蛋白亲和纯化 扩增培养重组表达菌，收集菌体并将其悬浮于1×缓冲液(5 mmol/L咪唑缓冲液)中，冰水中超声破碎(工作时间与间歇时间各3 s，功率为200 W，每次时间为20 min，共3次)，离心收集裂解液上清，纯化前用0.000 45 mm 滤膜过滤，并与Ni-NTA柱室温颠倒孵育2 h，重新装柱，用1×binding buffer将杂蛋白冲洗净，用300 mmol/L咪唑缓冲液将目的蛋白洗脱出来。
1.2.4 脾细胞增殖实验 引颈处死BALB/c，于超净台取脾并研磨成单细胞悬液，ACK裂解红细胞，用RPMI-1640培养液(10%胎牛血清)将单细胞悬液调为5×106cell/mL细胞数加入96孔细胞培养板中，实验孔中加入一定浓度的蛋白样品，对照孔加入等体积的培养基， 37 ℃ 5% CO2培养，48 h后无菌加入0.02 mL 噻唑蓝(浓度为5 mg/mL)，反应4 h后离心弃上清，加入0.15 mL DMSO，振荡10 min，检测OD 492 nm吸光度值。
1.2.5 腹腔巨噬细胞活化实验 取C57BL/6小鼠，每只小鼠腹腔注射2 ml 3%硫代乙醇酸钠，第3 天将小鼠引颈处死，无菌PBS灌洗小鼠腹腔，提取腹腔巨噬细胞(一般情况下不需使用ACK裂解红细胞)，用培养液将细胞浓度调至1.5×106/mL，置于96孔培养板中，实验组中加入一定浓度的蛋白样品，对照组加入等体积的培养基，于恒温培养箱中培养24 h后取上清液，测定其NO含量。
1.2.6 人外周血单个核细胞刺激实验 取正常人外周血，用淋巴细胞分离液无菌分离出单个核细胞，将细胞浓度调为5×106/mL加入96孔培养板中，实验组为一定浓度的蛋白样品，对照组为等体积的培养基，恒温培养箱中培养，12 h后取细胞培养上清，测定其TNF-α含量。
2 结果
2.1 rCRT/150-230原核表达载体构建
以pET28a-CRT质粒为模版，PCR法扩增rCRT/150-230 CDNA(图1A)，将该片段与pGEM-T Vector连接并测序成功后，经BamHI和HindⅢ 双酶切鉴定(图1B)，将酶切产物连接至pET28a，并转化至克隆菌DH5α中，挑取单克隆进行菌体PCR鉴定，得到大小与预期一致片段(图1C)，提取质粒并转化到表达菌株BL21中，经菌体PCR鉴定，重组质粒构建成功。
注：A为PCR扩增产物，B为双酶切鉴定结果(1为酶切质粒，2为未酶切质粒)，C为菌体PCR鉴定(1为rCRT/150-230菌PCR，2为空白对照)
2.2 rCRT/150-230蛋白表达及纯化
将构建好的原核重组表达菌株，于37 ℃，0.1 mmol/L IPTG条件下进行大量扩增及诱导表达，从细菌裂解液上清中检测到目的蛋白(图2A)，采用亲和层析法，提取目的蛋白(图2B)。
注：A为蛋白表达(1为未诱导菌液，2为诱导菌液上清，3为诱导菌液包涵体)，B为蛋白纯化(1为裂解上清液，2为流穿液，3为洗涤液，4为洗脱液)
2.3 rCRT / 150-230理化特性分析
对rCRT / 150-230及实验室原有的原核表达的CRT片段蛋白(rCRT/39-272，rCRT/120-250)进行理化特性分析，结果表明，CRT片段150-230蛋白纯度不低于90%。 Native-PAGE及SDS-PAGE跑胶结果显示，在自然状态下rCRT/150-230以多聚体的形式存在(图3A)，在没有还原剂2-ME存在的条件下，rCRT/150-230以二聚体形式存在(图3B)。标签蛋白部分并无半胱氨酸存在，排除重组蛋白rCRT/150-230两端的标签蛋白对蛋白理化性质的影响，说明蛋白存在分子间二硫键。
注：A为非变性胶鉴定(1为rCRT，2为rCRT/120-250，3为rCRT/150-230，4为rEGFP)， B为SDS-PAGE胶鉴定(1为rCRT/39-272，2为rCRT/120-250， 3为rCRT/150-230，4为 rEGFP)
2.4 rCRT/150-230免疫学活性
细胞实验鉴定目的蛋白的免疫学活性，结果表明，rCRT/150-230可有效促进脾细胞增殖(图4A)，还能够刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO(图 4B)，并且能够刺激正常人外周血单个核细胞(PBMC)分泌TNF-α(图4C)，并且刺激效果与全长CRT无显着差异。rCRT/150-230、rCRT组与rEGFP及空白对照组相比差异有统计学意义。
2.5 rCRT/150-230免疫原性
通过体内实验鉴定原核蛋白的免疫原性。结果显示，rCRT/150-230可使小鼠体内产生高滴度的抗rCRT/150-230特异性抗体(图 5A)，并且该抗体能够识别rCRT蛋白(图 5B)，说明该蛋白具有良好的免疫原性。
注：A为小鼠脾细胞增殖实验，B为小鼠腹腔巨噬细胞刺激实验，C为人外周血单个核细胞刺激实验；与对照组比较，(1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001
注：A为rCRT/150-230免疫血清抗体效价测定，B为rCRT/150-230血清抗体识别rCRT
3 讨论
CRT最早是从肌浆网中分离得到的一种Ca2+结合蛋白，在维持Ca2+稳态中发挥重要作用。随着研究不断深入，有学者发现CRT是一个多功能保守蛋白，广泛存在于生物体中，不仅存在内质网中发挥作用，在细胞膜及胞外都参与了生物学过程，膜型CRT在清除机体内凋亡的细胞及抵御肿瘤的免疫过程都发挥了重要作用[12-13]； 胞外也检测到可溶性CRT，尤其在类风湿性关节炎(RA)患者的血清和关节液中检测到了可溶性CRT的存在，而健康人中未检测到CRT[11]。Tarr等[14]研究发现，RA患者的血清及关节液中可溶性CRT与疾病活动度指标相关，提示了可溶性CRT在临床应用中可作为一个新的诊断指标或药物靶标。由于CRT具有与热休克蛋白相似的免疫学活性[15]，被认为是广义热休克蛋白家族的一员，参与机体的固有免疫系统和适应性免疫系统。本研究前期结果证实了可溶性CRT的免疫学活性，并且将CRT发挥免疫学活性的功能片段确定为39-272[11], 在实验室前期研究基础之上，本研究对CRT的功能片段进行更精确的研究。
本研究通过分子生物学方法，经PCR扩增出CRT片段150-230，成功构建rCRT/150-230原核表达质粒。结果表明，rCRT/150-230在原核表达菌中大部分以可溶性形式存在，不易降解，便于纯化。根据rCRT/150-230的氨基酸组成，分子内存在一个半胱氨酸，理论上可形成分子间二硫键，在维持二硫键自然存在的情况下，该蛋白是以二倍体的形式存在，与预期相符。对纯化得到的蛋白进行体内、体外实验检测其免疫生物学活性，体外细胞实验显示150-230片段蛋白促进了脾细胞分裂、诱导巨噬细胞产生NO、诱导人外周血单个核细胞产生细胞因子TNF-α。rCRT/150-230，这些生物学特性与Hong等[11]报道的rCRT/39-272的生物学活性相似。Huang等[16]研究表明，CRT的生物学活性受到蛋白寡聚化或多聚化程度的影响，多聚体形式的rCRT比单体形式的rCRT有更强的生物学活性，而自然状态下，Native-PAGE则显示rCRT/150-230是以多聚体的形式存在，其表现出较强的免疫生物学活性。本研究体内实验表明，150-230片段蛋白诱导小鼠发生体液免疫应答，产生高滴度的抗150-230片段蛋白与全长CRT抗体，即蛋白150-230片段具有很强的免疫刺激效果，与全长CRT相当。
本研究结果表明rCRT/150-230区域是CRT的主要免疫学活性区域，能否找到CRT更小的功能区域还有待进一步研究。
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(2015-04-18收稿，2015-05-26修回)
中文编辑： 刘 平； 英文编辑： 赵 毅
A Study of cDNA Cloning, Protein Expression and Immunological Activity of Calreticulin Fragment
ZHANG Lijuan， GAO Xiaoming
(InstituteofBiologyandMedicineSciences,SoochowUniversity,Suzhou215123,Jiangsu,China)
Objective: To investigate the major functional areas of calreticulin (CRT) that exerts immunobiological activity. Methods: Amplified a 150-230 fragment of rCRT and constructed a prokaryotic expression vector by molecular biology method. Then adopted E.Coli to express the protein which was purified by affinity purification. The biochemical property of rCRT/150-230 was tested. Analyzing the immunobiological activity of this proteininvitroandinvivo. Results: rCRT/150-230 protein was purified from the bacterial lysate supernatant, and it had good solubility and existed as polymer in nature. rCRT/150-230 could effectively stimulate the proliferation of mice spleen cells, and activate the secretion of NO of mice macrophage, and stimulate human peripheral blood mononuclear cells to secrete TNF-α, and has strong immunogenicity that induces the process of humoral immune response in mice. Conclusion: rCRT/150-230 appears similarity immunobiologic functions with rCRT, it could be inferred that it might be the major functional area of rCRT.
immunology； calreticulin； protein fragment； biological activity
时间：2015-08-07
http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150807.2241.014.html
R34-33
A
1000-2707(2015)09-0954-05
*通信作者 E-mail:xmgao@suda.edu.cn
