燃煤型氟中毒大鼠睾丸雄激素结合蛋白和转铁蛋白表达的变化*

李崇斌， 孙　发， 肖跃海， 田　源

(1.河北省胸科医院 泌尿外科， 河北 石家庄　050041; 2.贵州医科大学附院 泌尿外科， 贵州 贵阳　550004)



燃煤型氟中毒大鼠睾丸雄激素结合蛋白和转铁蛋白表达的变化*

李崇斌1， 孙发2**， 肖跃海2， 田源2

(1.河北省胸科医院 泌尿外科， 河北 石家庄050041; 2.贵州医科大学附院 泌尿外科， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 研究燃煤型氟中毒大鼠睾丸雄激素结合蛋白(ABP)和转铁蛋白(Tf)表达的改变。方法： 105只雄性SD大鼠为研究对象，随机分为对照组、低氟组、中氟组、高氟组、低氟加营养组、中氟加营养组及高氟加营养组，各染毒组喂饲含不同比例的地氟病区煤烘玉米的饲料(加营养组添加豆粉)，构建燃煤型氟中毒动物模型；各组动物于喂养90、120及180 d分3批处死，观察氟斑牙、尿氟，免疫组织化学法观察睾丸ABP和Tf表达的变化。结果： 大鼠氟斑牙分度和尿氟含量随时间及染毒剂量增加逐渐加重(高氟组>高氟加营养组>中氟组>中氟加营养组>低氟组>低氟加营养组，180 d>120 d>90 d)，差异有统计学意义(P<0.05或0.01)；与对照组比较，各染毒组ABP和Tf表达均减少，且随染毒剂量的增加和时间的延长，表达愈加减少(P<0.05或P<0.01)；在180 d时，同阶段同剂量染毒大鼠，加营养组ABP和Tf表达水平较高(P<0.05)。结论： 在燃煤型氟中毒大鼠睾丸中，随染毒剂量增加和染毒时间延长，ABP和Tf表达均减少；降低摄氟量及改善营养状况，可改善燃煤型氟中毒对大鼠睾丸ABP和Tf表达的影响。

[关键词]燃煤型氟中毒； 睾丸； 雄激素结合蛋白； 转铁蛋白； 免疫组织化学

氟中毒是一种全身中毒性疾病，不仅对骨骼、神经等系统有严重影响，研究发现氟中毒对男性生殖系统也有较大的损伤作用，可导致生殖功能下降，甚至不育[1-3]。燃煤型氟中毒作为慢性氟中毒的一种特殊类型，严重影响男性的生殖健康。雄激素结合蛋白(ABP)和转铁蛋白(Tf)作为一种特殊的中间转运蛋白，在睾丸生精和雄性激素内分泌功能中有发挥重要作用。本实验通过研究燃煤型氟中毒大鼠睾丸中ABP和Tf表达变化，探讨燃煤型氟中毒对睾丸生殖功能的损害机制，为研究燃煤型氟中毒对男性生殖系统的损伤机制提供科学的实验依据。

1材料和方法

1.1主要仪器、试剂

Water Purifier超纯水机 (四川沃特尔科技发展有限公司)，H-7650透射电镜(日本日立)，PXJ-1B型数字式离子计(江苏江分电分析仪器有限公司)，10%中性甲醛液，氟化钠(成都市联合化工试剂研究所)，去离子水(贵州医科大学公共卫生实验室提供)，ABP、Tf免疫组化试剂盒(武汉博士德)。

1.2实验动物分组

雄性SD大鼠105只，体质量110～130 g，根据体重均衡、随机分为对照组、低氟组、中氟组、高氟组、低氟加营养组、中氟加营养组及高氟加营养组，共7组，每组15只。对照组喂饲不含煤烘玉米的正常饲料，低、中、高氟组喂饲含25% 、50% 、75%病区煤烘玉米的饲料；低氟加营养组、中氟加营养组及高氟加营养组除喂养病区煤烘玉米外，还在饲料中添加豆粉。测定低氟、中氟、高氟组饲料含氟20、40及60 mg/kg。各组实验动物饲料配方及含氟量见表1。实验第90、120、180天以股动脉放血法处死动物[15]。

表1　各实验组动物饲料配方及含氟量(mg/kg)

(1)对照组玉米含氟量均值为1.3 mg/kg,病区煤烘玉米含氟量均值为80 mg/kg

1.3检测指标

分别于实验90、120及180 d时观察下列指标。

1.3.1氟斑牙氟斑牙分度标准：Ⅰ度(轻度)为牙表面黄白相间，白垩条纹清晰；Ⅱ度(中度)为牙表面呈无光泽粉笔样白色；Ⅲ度(重度)为牙表面出现小沟、裂纹或部分脱落，牙齿呈锯齿状严重缺损。

1.3.2尿氟代谢笼收集处死大鼠前1 d的 12 h尿液，用氟离子选择电极法测定尿氟含量。

1.3.3ABP及Tf表达以股动脉放血法处死动物，低温环境下迅速取出睾丸并固定于10%中性甲醛溶液中，常规制成病理切片，以SP法行ABP和Tf免疫组织化学染色，阴性对照以PBS代替一抗，具体操作步骤按照试剂盒说明书。细胞质着棕黄色者为ABP、Tf表达阳性。每个标本取5张切片，每张切片400倍镜下随机选取5个视野，在统一亮度、饱和度、对比度及增益条件下拍照，所得图片以image pro-plus6.0分析染色结果，计算光密度(optical density，OD)值。

1.4统计学方法

2结果

2.1氟斑牙

各染氟组大鼠在90 d开始出现氟斑牙，其分度随时间及染毒剂量逐渐加重(高氟组>高氟加营养组>中氟组>中氟加营养组>低氟组>低氟加营养组，180 d>120 d>90 d)，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，对照组未发现氟斑牙，180 d高氟组大鼠均为重度氟斑牙。

2.2尿氟

各染氟组大鼠尿氟含量随时间及染毒剂量逐渐增高，高氟组>高氟加营养组>中氟组>中氟加营养组>低氟组>低氟加营养组>对照组，180 d>120 d>90 d(P<0.05或P<0.01)，对照组各阶段尿氟含量正常。

2.3ABP和Tf表达

免疫组织化学染色结果显示，与对照组相比，各染氟组ABP和Tf表达均减少，且随染氟剂量的增加和时间的延长，表达愈加减少(P<0.05或P<0.01)。180 d各剂量染毒加营养组与同剂量、同阶段染毒组相比ABP及Tf表达均较高(P<0.05)。见表1及图1。

表2　各组大鼠睾丸组织ABP及Tf的OD值(×10-2)

与同时点对照组相比，(1)P<0.05，(2)P<0.01；(3)与同剂量染氟组90 d、120 d比较，P<0.05；(4)与同时点、同剂量染毒组比较，P<0.05

注：A～D分别为180 d 时对照组、高氟组、中氟组及低氟组ABP表达，E～H分别为180 d 时对照组、高氟组、中氟组及低氟组Tf表达图1　各组大鼠睾丸组织ABP及Tf表达(SP,×100)Fig.1　The expression of ABP and Tf in coal-burning fluorosis rat testis

3讨论

至今，已从形态学到内分泌再到基因、分子水平证实氟对男性生殖功能有慢性毒性作用，甚至可导致男性不育[4-8]。ABP和Tf是反映睾丸支持细胞(Sertoli细胞)分泌功能的两个客观指标。雄激素结合蛋白由睾丸支持细胞分泌，特异性地与睾酮结合并将其运送至整个生殖管道，使生精小管内维持较高浓度的睾酮水平，促进精子的产生和成熟，并为生精细胞的生长、发育及成熟提供适宜的内环境。转铁蛋白是由肝脏和睾丸支持细胞合成并分泌的。肝脏合成的转铁蛋白经血液运行到睾丸内，通过血睾屏障与睾丸支持细胞膜上的转铁蛋白受体结合形成复合物，脱离细胞膜进入细胞内的受体配体解偶联室，经酸化后铁从转铁蛋白上脱落下来，以铁蛋白的形式贮存于支持细胞，而转铁蛋白与其受体复合物返回细胞表面，与受体解偶联后经淋巴循环重新入血。睾丸支持细胞合成的转铁蛋白与细胞内贮存的铁结合后以顶端分泌的形式分泌至生精小管管腔内，主要被粗线期精母细胞及早期圆形精子细胞的受体所捕获，释放铁并贮存起来，铁离子供生精细胞利用，促进精子的生成及活力，而不含铁的转铁蛋白返回生精小管管腔液中再循环。由此可见，ABP与Tf对精子的生长、发育、成熟及精子活力有重要作用，ABP与Tf的合成及分泌减少，可影响生精小管内的睾酮水平及铁离子的含量，使生精细胞的生长发育障碍，精子活力下降，导致男性生殖功能下降甚至不育。在睾丸组织中，ABP与Tf均由Sertoli细胞分泌，其分泌减少提示Sertoli细胞受到损害。本课题组同期对燃煤型氟中毒大鼠睾丸的超微结构研究发现，睾丸支持细胞滑面内质网明显扩张甚至呈空泡样，线粒体减少，脂滴数量减少，溶酶体增多[7]；同时发现睾丸间质细胞的损伤，导致睾酮的分泌与合成下降，导致生精小管内睾酮水平降低，精子生成障碍，并出现一系列的低雄激素的表现。

关于氟对睾丸ABP与Tf表达的影响，国内外报道甚少。徐蕊等[9-10]研究发现，体外分离的Sertoli细胞，低浓度的氟(2.5 mg/L或5 mg/L)作用下ABP的表达升高(P<0.05)；更高氟浓度(10 mg/L、20 mg/L)ABP的表达降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。本实验以雄性SD大鼠为研究对象，通过喂饲含不同比例的病区煤烘玉米的饲料复制了燃煤型氟中毒动物模型，研究发现，各染毒组ABP和Tf表达均减少，且随染毒剂量的增加和时间的延长，表达更低，加营养组与同阶段、同剂量染毒组相比，ABP及Tf表达有所增加。

综上，燃煤型氟中毒可损伤睾丸支持细胞结构及功能，使雄激素结合蛋白及转铁蛋白合成及分泌减少，可能为氟中毒损伤男性生殖功能的机制之一，减少毒物的摄入及改善营养状况，可在一定程度上减轻氟中毒对男性生殖功能的损害。然而，燃煤型氟中毒对男性生殖功能的损害是多方面的，其机制有待于进一步研究。

4参考文献

[1] 张晨,凌冰,刘继文,等.氟砷染毒对雄性大鼠生殖功能的影响[J].中国地方病学杂志, 2000(6):404-405.

[2] 官志忠,王亚南, Dallner G .氟中毒引起SH-SY5Y神经细胞磷脂脂肪酸组成改变[J].贵阳医学院学报, 2010(5):445-447.

[3] 李艳,朱静媛,庄东刚,等.染氟大鼠血清雌二醇水平与生精细胞端粒酶逆转录酶表达关系的研究[J].卫生研究, 2006(5):546-548.

[4] 张晨,凌冰,刘继文,等.氟砷染毒对雄性大鼠生殖功能的影响[J].中国地方病学杂志, 2000(6):404-405.

[5] 张永春,孙发,谷江,等.燃煤型氟中毒对大鼠睾丸生精细胞凋亡的影响[J].贵阳医学院学报, 2010(5):445-447.

[6] 肖跃海,孙发,石家齐,等.燃煤型氟中毒大鼠睾丸组织中SCF mRNA的表达及意义[J].山东医药, 2010(46):1-3.

[7] 李崇斌,孙发,肖跃海,等. 燃煤型氟中毒对大鼠睾丸超微结构的影响[J].贵州医药, 2011(2):99-103.

[8] 李崇斌,孙发,肖跃海,等.燃煤型氟中毒大鼠血清和睾内睾酮水平的变化[J].贵阳医学院学报, 2011(1):1-4.

[9] 徐蕊,尚卫超.氟对大鼠睾丸支持细胞雄激素结合蛋白和抑制素B的影响[J].卫生研究, 2010(5):615-617.

[10]徐蕊,崔留欣.氟对大鼠睾丸支持细胞雄激素结合蛋白和抑制素B的影响[D].郑州:郑州大学硕士研究生论文, 2011.

(2015-11-25收稿，2016-02-22修回)

中文编辑： 周凌； 英文编辑： 刘华

Effects of Coal-burning Fluorosis on Androgen Binding Protein and Transferrin Expressed in Rat Testis

LI Chongbin1, SUN Fa2, XIAO Yuehai2, TIAN Yuan2

(1.DepartmentofUrology,HebeiProvincialChestHospital,Shijiazhuang050041,Hebei,China； 2.DepartmentofUrology,theAffiliatedHospitalofGuiyangMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To study effects of coal-burning fluorosis on expression of androgen binding protein (ABP) and transferrin (Tf) in rat testis. Methods: The male SD rats were randomly divided into 7 groups, including control group, low-dose fluoride group, middle-dose fluoride group, high-dose fluoride group, low-dose fluoride supplemented with nutrition group，middle-dose fluoride supplemented with nutrition group and high-dose fluoride supplemented with nutrition group. The experimental groups were fed with the fodder with different proportions of corn dried by burning coal coming from endemic fluorosis areas to establish the animal model of coal-burning fluorosis(soybean flour was added in nutrition-involved groups). All rats were killed by femoral arterial exsanguination at three times (90 d, 120 d, 180 d), followed by examinations of dental fluorosis, fluorine in urine. Immunohistochemical method was adopted to observe and analyze the changes of expression of ABP and Tf in rat testis. Results: The severity of dental fluorosis and the fluorine content in urine increased gradually along with the increase of exposure dose and time, and the differences between each group were statistically significant(P<0.05 or 0.01). Compared with the control groups, ABP and Tf expression in other experimental groups decreased significantly and with the increase of exposure dose and time, ABP and Tf expression decreased further(P<0.05 or 0.01). At day 180, compared with other groups of the same exposure dose and time, ABP and Tf expression level was relatively higher. Conclusions: With the exposure dose and exposure time extended, ABP and Tf expressed decreasingly in coal-burning fluorosis rat testis. Reducing fluorine intake and improving nutritional status could improve the expression of ABP and Tf in coal-burning fluorosis rat testis.

[Key words]coal-burning fluorosis; testis; androgen binding protein; transferrin; immunohistochemistry

[中图分类号]R599.5

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)03-0284-04

*[基金项目]中科院“西部之光”项目[黔科合计西光(2011)4003]； 贵州省科技厅国际合作项目(黔科合外G字2012-7015)； 贵州省省长基金[黔省专合字(2010)81]； 贵州省高层次人才基金(TZJF-2011年-27号)； 贵阳市科技局项目[筑科合(2012103)]

**通信作者 E-mail:sfguizhou@163.com

网络出版时间：2016-03-17网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160317.1031.026.html