丹参酮Ⅱ-A对大鼠成骨细胞BMP-2表达的影响*

莫朝伦， 张军梅**， 贾　莹， 王薮馨， 杨夏晴， 冯安琪

(1.贵州医科大学 口腔医学院 口腔正畸学教研室， 贵州 贵阳　550004； 2.贵阳市口腔医院， 贵州 贵阳　550004)



丹参酮Ⅱ-A对大鼠成骨细胞BMP-2表达的影响*

莫朝伦1， 张军梅1**， 贾莹1， 王薮馨1， 杨夏晴2， 冯安琪1

(1.贵州医科大学 口腔医学院 口腔正畸学教研室， 贵州 贵阳550004； 2.贵阳市口腔医院， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 观察丹参酮Ⅱ-A(TsⅡ-A)对大鼠大鼠成骨细胞(OB)中骨形成蛋白-2(BMP-2)mRNA 表达的影响。方法: 培养原代大鼠OB并传代接种后采用Cell Counting Kit-8试剂盒比色法检测5×10-3、5×10-2以及5×10-1mg/L 3个浓度的TsⅡ-A(统称实验组)和对照组(0 mg/L TsⅡ-A)在第1、3、5、7天对OB的促增殖作用；RT-qPCR 检测各组OB BMP-2 mRNA 的表达。结果： 不同浓度TsⅡ-A对OB均有促增殖的作用(P<0.05)，其中5×10-2mg/L浓度组促增殖作用最大；在各时间段中，组间比较OB BMP-2 mRNA表达量，实验组均高于对照组(P<0.05)；各实验组组内比较，OB BMP-2 mRNA表达趋势为第7天>第5天>第3天>第1天(P<0.05)。结论： TSⅡ-A在一定的作用时间内可促进OB增殖，并上调OB中BMP-2 mRNA表达水平。

[关键词]丹参酮Ⅱ-A； 成骨细胞； 骨形成蛋白-2； 大鼠，Sprague-Dawley； 信使RNA

丹参属于经典活血化瘀类中药,是中医骨伤科方剂中的常用药，可促进骨的钙化，在骨折治疗中应用丹参后成骨细胞(osteoblast,OB)在数量及分布部位均明显增多[1-4]。丹参酮Ⅱ-A(tanshinone Ⅱ-A，TsⅡ-A)属于丹参的有效活性成分，具有雌激素样活性、抗菌消炎和促骨代谢等药理作用[5]。近年来，有学者应用TsⅡ-A于正畸治疗的实验研究中，表明了TsⅡ-A对牙周组织、颌骨改建和调节具有一定的影响作用[6-7]。至今，有关TsⅡ-A对OB增殖分化等方面的研究甚少，其中的相关机制研究不多且不够深入。本实验通过体外培养大鼠OB，观察TsⅡ-A对大鼠OB增殖影响，并采用实时定量PCR(real time PCR)方法，测定TsⅡ-A对大鼠OB骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)mRNA表达的影响，探讨TsⅡ-A在OB增殖中可能存在的作用机制,为TsⅡ-A的药理学作用提供理论参考。

1材料和方法

1.1材料

TsⅡ-A购于Aladdin-阿拉丁试剂(上海)有限公司。新生1～ 2 d SD大鼠乳鼠，体质量7～8 g，清洁级 ,由贵州医科大学实验动物中心[SCXK(黔)2012-0001]提供。DMEM高糖培养基(Hyclone，美国)，胎牛血清(FBS，杭州四季青)，青/链霉素双抗(北京索宝莱生物科技有限公司)，0.1%Ⅰ型胶原酶(Gibco，美国)，0.25%胰蛋白酶(Hyclone，美国)，Cell counting Kit8(CCK-8)细胞增殖-毒性检测试剂盒(日本同仁)，ALP试剂盒(南京建成生物工程研究所)，茜素红指示剂(北京索宝莱生物科技有限公司)。Trizol总RNA提取试剂盒(美国Invitrogen)，引物序列设计及合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，逆转录试剂盒(美国Thermo)，荧光mix(瑞士ROCH)。超净工作台(苏净集团安泰公司)，CO2细胞培养箱(MCO-18AIC型，Sanyo，日本)，离心机(HC-2062)，核酸蛋白分析仪(Beckman coulter DU 640型,Beckman，美国)，梯度PCR扩增仪(Eppendorf,美国)，实时荧光定量PCR仪(CFX ConnectTM Real-time System,BIO-Rad,美国)。

1.2方法

1.2.1OB分离、培养及传代纯化取1～2 d SD大鼠6只，取其颅盖骨于完全培养基中修剪成1 mm3的碎骨片，将碎骨片移至15 mL离心管中，通过2次酶消化法提取原代OB，并于37 ℃、5%的CO2培养箱内进行培养,每2～3 d换液1次，待细胞铺满瓶底80%以上后进行传代并利用差速贴壁法纯化OB至第三代[8]。

1.2.2OB增殖情况采用CCK-8试剂盒比色法检测OB增殖情况。第3代OB以2×104个/mL密度的细胞悬液接种于96孔板(100 μL/孔),各组设4个复孔。依据TsⅡ-A浓度梯度分组(0、5×10-3、5×10-2以及5×10-1mg/L)，0 mg/L TsⅡ-A为对照组，其余浓度为实验组，设1、3、5、7 d 4个检测时间点。各孔待测细胞均用CCK-8溶液10 μL孵育2 h后，酶标仪450 nm处读取OD值。1.2.3BMP-2mRNA表达RT-qPCR法检测BMP-2mRNA表达。细胞处理：将0和5×10-2mg/L的TsⅡ-A分别处理第三代OB至1、3、5、7 d后，用TRizol试剂提取细胞总RNA。核酸蛋白分析仪检测RNA浓度、纯度，采用逆转录酶和 Oligod(T)18，dNTP将总RNA逆转录成cDNA，以cDNA产物为模板Real-time PCR，采用RT-qPCR Sybr Green法测定，每个样品设3个复孔，以BMP-2为目的基因，β-actin 为内参照，引物序列设计及合成委托于上海捷瑞生物工程有限公司(表1)。反应体系20 μL，含有cDNA 5 μL，荧光mix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL。mRNA扩增条件95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃延伸1 min，共40个循环。ABI step one plus型荧光定量PCR仪采集待测基因及内参照β-actin扩增各循环荧光信号，以Applied Biosystems SDS 14.0软件进行荧光采集和数据分析。实时定量PCR结果由荧光定量分析仪自动采集并给出目的基因和参比基因的CT值，用2-ΔΔCT法对基因表达的CT值分析，其中ΔΔCT=ΔCT实验-ΔCT对照，实验组及对照组ΔCT=CT目的-CT内参，以目的基因的相对表达量用于统计分析。

表1　RT-qPCR引物序列

1.3 统计学分析

2结果

2.1CCK-8检测结果

各实验组TsⅡ-A均可促进OB增殖；5×10-2和5×10-1mg/L浓度组在第1、3、5天对OB的促增殖作用显着(P<0.05)，其中5×10-2mg/L浓度组促增殖作用最为显着(P<0.05)；5×10-3mg/L浓度组在第3、5天对OB的促增殖作用显着，差异有统计学意义(P<0.05)；各实验组在第7天时间点对OB的促增殖作用与对照组相比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.2总RNA鉴定及BMP-2 mRNA表达

所提取的总RNA纯度在 1.8～2.0，电泳条带清晰，28 S∶18 S带亮度约为2∶1,5 S带较模糊，无明显降解，完整性好,见图1。在各时点实验组BMP-2 mRNA表达量均高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；实验组各时点BMP-2 mRNA表达趋势为第7天>第5天>第3天>第1天，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2。

表2　不同浓度TsⅡ-A对OB增殖的影响(OD值，

(1)与对照组比较，P<0.05

图1　琼脂凝胶电泳鉴定总RNAFig.1　Agarose gel electrophoresis of total RNA

(1)实验组不同时点比较，P<0.05图2　OB中BMP-2 mRNA的表达Fig.2　Comparison of BMP-2 mRNA expression of osteoblast among groups

(1)不同时间点比较，P<0.05图3　实验组OB中BMP-2 mRNA的表达Fig.3　Intro-group comparison of BMP-2 mRNA expression of osteoblast in experiment group

3讨论

骨骼具有可塑特性,颌骨是骨骼中可塑性很强的组织，颌骨的可塑性是正畸治疗的生物学基础，其主要体现在破骨与成骨平衡的生理过程，OB是骨塑建的物质基础，是骨组织更新活动中最重要的功能细胞和效应细胞[9]。OB可通过分泌一些细胞因子参与骨形成过程，同时控制骨基质的矿化过程，其中BMPs是目前比较受关注的与骨诱导有密切关系的一种骨生长因子，表现为诱导成骨作用[10]。其中，BMP-2属于转化生长因子-β(transforming growthfactor-β，TGF-β) 超家族成员，是研究和应用最广泛的生长因子，是促进骨形成和诱导OB分化最重要的细胞外信号分子之一，可上调多种基因表达，并通过与多种细胞因子形成BMP-2 信号通路[11-13]。BMP-2信号通路参与OB分化和骨细胞细胞外基质合成与分泌，促进骨形成，形成骨塑建，维持骨量。

丹参作为中医常用的活血化瘀类中药,具有促进骨折愈合、强骨补肾的功效，已被广泛应用于骨折的实验研究和治疗中，其不仅能改善骨折处血供，还能促使OB数量及分布部位相应增多，促进骨的钙化。相关研究证明，丹参能够提高成骨样细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性，促进OB功能，从而促进新骨形成，丹参还可通过提升破骨细胞(osteoclast，OC)的数量，促进牙槽骨塑建，加快正畸牙的移动等作用[14]。TsⅡ-A是丹参中最为丰富、结构最具有代表性的丹参酮，为丹参的主要脂溶性成分，其不仅具有心血管系统相应药理作用，还具有雌激素样活性、抗菌消炎和促骨代谢等药理作用[5]。相关研究表明，TsⅡ-A在OB-OC共育体系中可明显提高OB增殖和ALP活性[15]。

本实验采用CCK-8法检测在不同浓度TsⅡ-A的作用下对大鼠乳鼠颅盖骨OB体外增殖的影响，结果显示，5×10-3、5×10-2和5×10-1mg/L 3个浓度TsⅡ-A均可促进OB增殖，其中5×10-2mg/L浓度组促细胞增殖作用最明显，提示该药物浓度为本实验药物浓度范围内相对最佳值，说明适宜浓度TsⅡ-A对体外培养的大鼠乳鼠颅盖骨OB具有促进细胞增殖作用，这与夏金鑫等[15]研究结果相一致。本实验检测5×10-2mg/L浓度TsⅡ-A对OB中BMP-2 mRNA表达的影响，结果显示，在各检测时间点BMP-2 mRNA表达量实验组均高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，证明本实验采用的TsⅡ-A可上调OB中BMP-2 mRNA的表达水平，提示了TsⅡ-A可能存在促进骨形成的作用。各浓度TsⅡ-A组内比较，BMP-2 mRNA表达量随时间推移呈上升趋势，差异有统计学意义(P<0.05)，提示TsⅡ-A可能呈渐进性影响BMP-2 mRNA表达。

综上所述，本实验应用的TsⅡ-A对体外培养OB具有一定的促增殖作用，以5×10-2mg/L浓度TsⅡ-A促进作用最为显着，且在一定的作用时间内，可上调BMP-2 mRNA表达量，其表达量呈时间依赖性。TsⅡ-A可能通过上调BMP-2 mRNA表达水平来促进OB增殖，进而可能影响着正畸矫治中颌骨改建过程。有关TsⅡ-A对OB增殖分化影响的具体作用机制有待进一步研究。

4参考文献

[1] 张丁,傅民魁,傅嘉.丹参对离体破骨细胞的影响[J].口腔正畸学, 1995(2):63-64.

[2] 史炜镔,符诗聪,杜宁,等.丹参有效部位对骨折愈合过程中胶原基因表达的影响[J].中国中西医结合杂志, 2000(4):269-271.

[3] 林润台,王忠,刘立波,等.丹参促进下颌骨骨折愈合的超微结构研究[J].中华口医学杂志, 1992(4):215-216.

[4] Liu YR,Qu SX,Maitz MF,et al.The effect of the major components of salvia miltiorrhiza bunge on bone marrow cells[J] .Ethnopharmacol, 2007(3):573-583.

[5] 张萌涛,钱亦华,唐安琪.丹参酮ⅡA药理作用的研究进展[J].医学综述， 2010(17)：2661-2664.

[6] 杨夏晴，张军梅，王薮馨，等.局部注射丹参酮ⅡA对兔正畸牙移动中破骨细胞的影响[J].贵阳医学院学报， 2015(10)：1054-1059.

[7] 张世英，刘继光，赵刚.丹参酮ⅡA 局部注射正畸牙移动后复发阶段破骨细胞分化因子的表达[J].中国组织工程研究， 2014(11):1730-1736.

[8] 胡泽兵，曹新生，张舒.成骨细胞体外培养技术[J].中国骨质疏松杂志， 2014(11)：1276-1282.

[9] Song K,Zhao G,Liu T,et al. Effective of umbilical cord blood hematopoietic stem/progenitor cells by regulation of microencapsulated osteoblasts under hypoxic condition [J].Biotechnology Letters, 2009(7):923-928.

[10]De-Luca F，Barnes KM，Uyeda JA，et al．Regulationof growth platechondrogenesis by bone morphogenetic protein-2[J]. Endocrinology， 2001(1)：430-436．

[11]Grgurevic L，Macek B，Mercep M，et al．Bone morphogenetic protein ( BMP) 1-3 enhances bone repair[J].Biochem Biophys Res Commun， 2011(1)：25-31．

[12]Sato C，Iwasaki T，Kitano S，et al．Sphingosine 1 phosphate receptor activation enhances BMP-2-induced osteoblast differentiation[J]．Biochem Biophys Res Commun， 2012(1)：200-205．

[13]Mai Z，Peng Z，Wu S，et al．Single bout short duration fluid shear stress induces osteogenic differentiation of MC3T3E1 cells via integrin β1 and BMP2 signaling cross-talk[J]．PLoS One， 2013(4):e61600．

[14]梅银生，贾玉龙，张丽娜.川续断和丹参影响大鼠正畸牙移动的比较[J].山东大学学报:医学版， 2010(8)：60-64.

[15]夏金鑫.丹参酮ⅡA对成骨-破骨共育体系中成骨细胞活性及IGF-ImRNA的影响[D].暨南大学， 2008.

(2016-01-03收稿，2016-04-30修回)

中文编辑： 刘平； 英文编辑： 赵毅

The Expression of BMP-2 mRNA of Rat Osteoblast Cultured with Tanshinone Ⅱ-A

MO Chaolun1, ZHANG Junmei1, JIA Yin1, WANG Souxi1, YANG Xiaqing2, FENG Anqi1

(1.DepartmentofOrthodontics,theSchoolofStomatology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.GuiyangStomatologicalHospital,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the effects of Tanshinone Ⅱ-A on expression of the bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) mRNA of rat osteoblasts. Methods: the original generation of rat osteoblasts were cultivated and passaged, and Tanshinone Ⅱ-A was supplemented into the culture medium of osteoblast at 5×10-3mg/L, 5×10-2mg/L, 5×10-1mg/L respectively．Cell Counting Kit-8 Kit colorimetry were used to detect the proliferation of osteoblast on the 1st, 3rd, 5th, 7thday, the expression of BMP-2 mRNA was checked by RT-qPCR. Results: All concentrations of Tanshinone Ⅱ-A were promoting proliferation of osteoblast (P<0.05), which 5×10-2mg/L demonstrated the greatest effect. The expression of BMP-2 mRNA of experimental group was higher than control group in each period through comparison (P<0.05), while the intra-group comparison displayed that the expression of BMP-2 mRNA showed an increasing trend with time went by(P<0.05). Conclusions: Tanshinone Ⅱ-A promoted the proliferation of osteoblasts in a certain time significantly, and which also could increase the expression level of BMP-2 mRNA .

[Key words]tanshinone Ⅱ-A； osteoblast； bone morphogenetic protein-2; rats，Sprague-Dawley； messenger RNA

*[基金项目]贵阳市科技局基金筑科合同(20151001)

[中图分类号]R285； R329.2

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)05-0559-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.016

**通信作者 E-mail:zjm46688@126.com

网络出版时间：2016-05-13网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2153.054.html