cdh5-mRNA在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达模式

吴西军， 姚冬静， 刘庆， 杨小燕， 王念雪， 王一慧， 舒莉萍， 何志旭**

(1.贵州医科大学 组织工程与干细胞实验中心， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学 免疫学教研室， 贵州 贵阳 550004； 3.河北省人民医院 儿科， 河北 石家庄 050057； 4.贵州医科大学附院 呼吸与危重症医学科， 贵州 贵阳 550004； 5.贵州医科大学附院 儿童血液肿瘤科， 贵州 贵阳 550004)

cdh5在胚胎发育早期成体血管发生、血管重塑、内皮连接及血管通透性调节等过程中有重要的作用[1-3]，同时在胚胎期造血发育过程中也有重要作用[4-6]。目前对cdh5的研究中，多采取的是断面研究的方法，不能系统地展示cdh5基因在急剧变化的发育过程中的表达模式，而基因的正常表达模式是研究基因功能的基础，因此研究cdh5基因的正常表达模式就显得很有必要。由于大的模式生物多为体内受精、宫内发育，给持续、系统地观察胚胎期基因的变化情况带来了很多的限制[7]。本研究以野生型斑马鱼胚胎作为研究对象，利用其体外受精、宫外发育且系统发育高度保守的特性[8]，通过全胚胎原位杂交技术(whole-mount in situ hybridization, WISH)检测cdh5基因在tǘebingen 野生型斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达，获得cdh5-mRNA的表达谱，探究cdh5-mRNA的表达模式，为探讨cdh5基因在斑马鱼血管发生、发育及早期造血发育中的作用提供基因表达谱参照。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 野生型tǘebingen 斑马鱼系养殖在恒温(28±0.5)℃的循环水系统，光照时间14 h/d，斑马鱼胚胎由课题组自行繁育。

1.1.2实验试剂pCS2+真核生物表达质粒和DH5α工程菌株由贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心保存，Trizol试剂、逆转录试剂first- strand plus kit购于invitrogen公司，小提质粒试剂盒购于Axyren公司，DNA凝胶回收试剂盒、DNA marker购于北京天根生物公司，PCR引物由上海捷瑞生物有限公司合成，EcoR1和Xba1 内切酶、T4连接酶均购于fermentas公司，KOD DNA聚合酶购于TOYOBO 公司，地高辛RNA标记和检测试剂盒及NucAwayTMSpin Columns购自Ambion公司，BCIP/NBT购自VECTORLab。

1.2 实验方法

1.2.1野生型斑马鱼总RNA的提取及cdh5基因克隆 以受精后小时数(hours-post-fertilization, hpf)作为斑马鱼胚胎发育时点的单位。收集Tuebingen野生型斑马鱼0.75、3.75、9、12、18、30、36、48、72 hpf多个时相点的胚胎，每个时相点取5枚，置于1.5 mL的Epp管中，加入Trizol 1 mL充分匀浆处理，提取其总RNA、按SuperScriptTM111 First-Strand Systhcsis System kit试剂盒步骤进行反转录。根据斑马鱼cdh5的基因序列(NM_001003983.1)，用primer5.0软件自行设计引物，同时引入EcoR1以及 XbaⅠ酶切位点以及保护碱基，cdh5基因上游引物为5′CGGAATTCTTCCAATCAGGGAAAACGAC-3′，下游引物为5′GCTCTAGACA GCTTTGCAAGGACAACAA-3′，由上海捷瑞生物有限公司合成。以逆转录得到的cDNA为模板，进行cdh5的RT-PCR扩增，扩增条件为94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、68 ℃延伸2 min，共30个循环，最后68 ℃后延伸10 min，产物大小为378 bp，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳鉴定完毕后将目的条带割胶回收备用。

1.2.2pCS2+-cdh5 重组质粒的构建与鉴定 将cdh5基因的RT-PCR产物和pCS2+质粒EcoR I和Xba I双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，用T4酶连接回收的酶切片段，将连接产物运用钙转法转入E.coliDH5α感受态菌中，经氨苄抗性筛选出阳性克隆并扩增后，运用碱裂解法提取pCS2+-cdh5 重组质粒。鉴定pCS2+-cdh5 重组质粒，(1)酶切，用 XbaⅠ单酶切或EcoR I及Xba I双酶切pCS2+-cdh5 重组质粒，通过琼脂糖凝胶电泳，判断酶切产物大小；(2)菌落PCR，pCS2+-cdh5 重组质粒转染大肠杆菌，PCR扩增后行琼脂糖凝胶电泳，判断扩增产物大小；(3)序列测定，将重组质粒送至北京诺赛生物技术公司进行序列测定，得到测定序列后进行序列比对。

1.2.3cdh5反义mRNA探针制备 将pCS2+-cdh5 重组质粒用EcoR I酶切，DNA纯化试剂盒割胶回收得到线性化的DNA片段。以线性化的pCS2+-cdh5 DNA片段为模板，以地高辛标记的寡核苷酸为原料，经T3RNA体外转录体系转录得到的cdh5反义mRNA探针；用NucAwayTMSpin Columns纯化吸附柱回收cdh5反义mRNA探针，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，分装后于-70 ℃保存备用。

1.2.4野生型斑马鱼胚胎原位杂交 选取0.75、3.7、6、9、12、18、24、30、36、48及72 hpf的Tuebingen野生型斑马鱼胚胎进行WISH，首先用l×PBST溶液洗去固定液，不同浓度的甲醇进行梯度脱水后，胚胎68 ℃预杂交1 h，加入cdh5反义mRNA探针，于68 ℃杂交过夜，不同浓度的含吐温20的柠檬酸钠与氯化钠缓冲液洗去过多的探针，加入地高辛抗体后过夜，含吐温的马来酸缓冲液(MABT)洗去过多的抗体，加入BCIP/NBT染液进行染色，用固定液对杂交胚胎进行固定并照相，记录结果。

2 结果

2.1 cdh5 基因片段 RT-PCR扩增

以收集的斑马鱼胚胎总 RNA 为模板，体外逆转录得到 cDNA，RT-PCR 扩增后经琼脂糖凝胶电泳分析显示，在对应泳道可见一清晰的条带，大小与预期 378 bp相符。见图1。

注：1为DNA marker，2为cdh5 PCR产物，3为空白对照。图1 cdh5 基因 RT-PCR 产物琼脂糖凝胶电泳结果Fig.1 RT-PCR product analysis of cdh5 gene

2.2 pCS2+-cdh5重组质粒酶切鉴定

pCS2+-cdh5重组质粒经 XbaⅠ单酶切及XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示，在pCS2+-cdh5和pCS2+泳道均可见一条带，大小约4 100 bp，在cdh5基因片段及pCS2+-cdh5 XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切泳道均可见约378 bp大小的条带，与目的基因条带相符，表明目的基因cdh5 DNA片段成功插入pCS2+载体中。见图2。

注：1为DNA marker，2为cdh5 PCR产物，3为pCS2+-cdh5双酶切产物，4为pCS2+酶切产物，5为空白对照。图2 pCS2+-cdh5重组质粒EcoRⅠ、 XbaⅠ双酶切产物琼脂糖凝胶电泳结果Fig.2 Digestion products of pCS2+-cdh5 recombinant plasmid by EcoRⅠ and XbaⅠ

2.3 pCS2+-cdh5重组质粒菌落 PCR 鉴定

以pCS2+-cdh5重组质粒转染后菌液为模板， PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果显示，对应泳道可见约378 bp大小的特异性扩增条带，与预期相符，表明cdh5 基因片段成功插入了pCS2+质粒中。见图3。

注：1为DNA Maker，2为重组质粒 PCR产物，3为空白对照。图3 pCS2+-cdh5重组质粒菌落PCR琼脂糖凝胶电泳结果Fig.3 Colony PCR analysis of recombinant plasmid pCS2+-cdh5

2.4 pCS2+-cdh5重组质粒测序鉴定

pCS2+-cdh5重组质粒 DNA 经序列测序，将测序结果在Genbank 中进行比对，证实得到的序列与cdh5 基因序列完全一致。见图4。

图4 pCS2+-cdh5重组质粒测序结果Fig.4 DNA sequencing analysis of recombinant plasmid pCS2+-cdh5

2.5 野生型斑马鱼cdh5基因mRNA全胚胎原位杂交

野生型斑马鱼cdh5-mRNA原位杂交结果显示，0.75 hpf的胚胎未见阳性杂交信号，3.7～12 hpf的胚胎可见cdh5-mRNA无特异性表达，18～36 hpf的胚胎cdh5-mRNA开始在血管和脑部高表达，特别是胚胎造血组织高表达，在18～24 hpf胚胎造血组织的中间细胞群、18～36 hpf胚胎尾部血岛、30～36 hpf胚胎主动脉-性腺-中肾区及24～72 hpf胚胎的脑部组织中均可以观察到dh5-mRNA阳性杂交信号。提示在野生型斑马鱼胚胎发育过程中，cdh5-mRNA除在脑部和血管表达外，在造血组织中表达量亦较高，18 hpf已有明显表达，30 hpf为其表达高峰，后逐渐减少。见图5。

注：A～K示0.75～72 hpf,红色箭头所指为中间细胞群，蓝色箭头所指为主动脉-性腺-中肾区，绿色箭头所指为尾部血岛，黄色箭头所指为脑部。图5 0.75～72 hpf野生型斑马鱼胚胎cdh5-mRNA全胚胎原位杂交结果Fig.5 Whole-mount in situ hybridization using antisense cdh5-mRNA in zebrafish at different hours post-fertilization

3 讨论

模式生物斑马鱼作为桥梁模式生物，具有体外受精、宫外发育、胚胎早期通体透明等特点，这些重要特征为研究生物体胚胎早期的生长发育以及组织器官的发生、发育提供了便利条件，可以对活体胚胎发育情况进行系统的、连续的观察和科学研究，是发育生物学和遗传学等学科极为理想的模式生物[9-10]。WISH利用灵敏度较高的探针进行标记，技术简单可靠性高，可以反映在胚胎发育整体水平中基因表达的三维时空性，被用于替代免疫组织化学研究和基于基因表达的胚胎期发育调控研究。

1990年在禽类研究中首先发现cdh5(CD144、VE-cadherin)，随后在人和小鼠的血管内皮细胞也发现了cdh5的存在，cdh5 在进化中是高度保守的[11-12]。cdh5是一种跨膜蛋白，其胞外氨基端与相邻血管内皮细胞上cdh5同型胞外结构域互相黏附，胞内梭基端与膜内蛋白 P120、斑珠蛋白(plakoglobin)及ß-catenin结合，可在所有类型的血管内皮细胞中持续表达，一定程度上具有血管内皮特异性。通过介导细胞间的黏附连接在胚胎发育早期阶段的血管发生和重塑过程中起关键作用[13-14]。

已有研究发现成血管细胞(flk1+cdh5-)和已经定向了的内皮细胞(flk1+cdh5+)都具有分化成造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)的能力，而flk1+Cdh5+的内皮细胞被认为是HSC的直接来源[15]。在体外培养时cdh5+的细胞也可以发育为各系的造血细胞，体内的研究也发现cdh5+的细胞在体内可以发育成 HSC，并可以迁移到胎肝、骨髓等造血组织中[16-18]。通过对免疫缺陷小鼠进行细胞移植的相关研究表明，cdh5+的细胞群比cdh5-细胞群显示了更加出色的自我更新、增殖及分化潜能[19-20]。

本实验提取了不同发育节点Tuebingen野生型斑马鱼胚胎总RNA，通过cdh5基因特异性引物，扩增出了cdh5基因特异性的DNA片段，通过酶切、连接、转化、质粒提取等环节，得到了pCS2+-cdh5重组质粒；将重组质粒进行双酶切、质粒菌落PCR及序列测定等方法鉴定，所得到的基因序列与cdh5基因序列完全一致；制备了cdh5基因特异性片段地高辛标记的反义mRNA探针，用WISH检测，结果表明cdh5-mRNA除在后脑和血管处表达外，在造血组织高表达，30 hpf为其表达高峰，后逐渐减少。

综上所述，本研究明确了野生型斑马鱼cdh5-mRNA的表达模式，为研究cdh5-mRNA表达模式提供了参照，同时为研究cdh5在胚胎期发育调控中的作用提供支撑。但是mRNA的表达模式并不能完全代表蛋白质的表达模式，利用带标记的cdh5抗体示踪其表达情况将更为精确，但是目前尚未见斑马鱼cdh5抗体的相关报道，因此斑马鱼cdh5 mRNA的表达模式研究在目前就非常必要。