糖通饮对2型糖尿病大鼠胰腺组织PI3K-AKT通路的影响*

马欢， 高楠楠， 陈俞如， 肖瑛,2， 潘艳伶,3**

(1.贵州医科大学， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州省常见慢性疾病发病机制及药物研究重点实验室， 贵州 贵阳 550025； 3.贵州医科大学附院， 贵州 贵阳 550004)

全世界有超过4.15亿人患有糖尿病，据估计到2040年发病率将增加到6.42亿[1]。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是一种常见的糖尿病类型，是一类以胰岛素分泌缺乏和(或)机体产生胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)的常见内分泌代谢性疾病[2]，占全球糖尿病病例的90%～95%[3]。T2DM的主要并发症包括糖尿病肾病、糖尿病周围神经病变、心血管疾病及肥胖[4-5]，目前临床应用的主要药物是胰岛素及其分析物(磺酰脲类、格列奈类、双胍类及葡萄糖苷酶抑制剂等)，尽管这些药物能有效的起到降血糖作用，但也存在肝毒性、肾毒性及低血糖反应等各种副作用[6]。有研究表明，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)信号通路异常是T2DM发生的重要原因[7]，本课题组在临床及前期实验中证实经验方“糖通饮”可有效降低T2DM患者或T2DM大鼠的空腹血糖(FBG)[8-10]，本研究通过观察大鼠胰腺组织中PI3K-AKT信号通路关键信号因子AKT和胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate，IRS-1)的变化，同时检测大鼠体质量和空腹血糖(FBG)，探讨糖通饮的降糖机制，报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物 SPF级SD雄性大鼠，体质量(180±20)g，由重庆腾鑫生物技术有限公司提供，许可证号SCXK(军)2012-0011；大鼠饲养于贵州医科大学临床医学实验中心动物房，自由摄水摄食，室温22～26 ℃，湿度40%～60%。

1.1.2药物与试剂 糖通饮(方药组成为生地黄12 g、山药15 g、山茱萸15 g、茯苓15 g、泽泻9 g、丹皮10 g、黄芪15 g、丹参15 g、地骨皮15 g及草决明15 g)由贵州医科大学附属医院中药房提供，链脲佐菌素(STZ，北京索莱宝科技有限公司，批号615K0321)、兔SP试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号K187913H)、逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司，批号AI40772A)。

1.2 方法

1.2.1T2DM模型制备 50只SPF级SD雄性大鼠适应性饲养1周后，将空腹体质量值由高到低排列，采用随机数字表法，分取大鼠10只作为对照组给予基础饲料喂养、其余40只给予高脂饲料(普通饲料58%、精炼猪油20%、糖20%及胆固醇2%，由贵州医科大学动物房提供)喂养8周(造模诱发IR)；2组大鼠禁食不禁水12 h，称取体质量后，造模组大鼠给予1%STZ的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4.5)按20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg腹腔注射、共3次，对照组则注射相应剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；注射72 h后尾静脉采静脉血检测大鼠餐后随机血糖≥16.7 mmol/L[11]，且尿量和饮水量明显增多者为T2DM成模大鼠。

1.2.2分组与干预方法 将40只糖尿病成模大鼠按餐后随机血糖由高到低排序，采用随机数字表法，分为模型组，糖通饮低、中、高剂量组各10只，分别给予糖通饮水煎剂10、20及30 mg/kg灌胃，对照组与模型组给予等体积双蒸水灌胃，每日1次，连续灌胃8周。实验过程中，因灌胃或大鼠高血糖等原因死亡7只，其中模型组、低剂量组及中剂量组各2只，高剂量组1只。

1.2.3标本采集 给药8周时，所有大鼠禁食不禁水12 h，称取体质量，尾静脉采血，采用葡萄糖氧化酶法测定FBG；腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg麻醉大鼠后处死，快速开腹摘除胰腺组织分别置于-80 ℃冰箱和4%多聚甲醛中，以备检测胰腺组织中PI3K-AKT通路相关因子AKT、IRS-1 mRNA与蛋白的表达。

1.2.4大鼠胰腺组织中AKT、IRS-1 mRNA的表达 采用逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法，提取胰腺组织总RNA(离心柱型动物组织总RNA提取试剂盒)，验证RNA纯度，使用Takara反转录试剂盒将mRNA反转录为cDNA；按照qPCR试剂盒操作说明书配置反应体系，在qPCR仪以3步法进行PCR反应，40个循环后采集荧光信号，实验重复3次，PCR引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，见表1。采用荧光定量PCR相对定量分析法2-ΔΔCT法进行统计分析。

表1 PCR引物序列Tab.1 Sequence of PCR primers

1.2.5胰腺组织中AKT和IRS-1蛋白表达 采用免疫组织化学法检测，取固定好的石蜡切片(5 μm)常规脱蜡至水，滴加3%的双氧去离子水、抗原热修复、滴加正常山羊血清封闭液，勿洗。滴加AKT和IRS-1一抗(1 ∶150)，4 ℃冰箱过夜，滴加生物素标记二抗，37 ℃孵育1 h。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，DAB显色，苏木素复染脱水透明中性树胶封片，镜检，观察AKT和IRS-1蛋白阳性表达，以细胞内出现的淡黄色至棕黄色颗粒作为阳性细胞，阳性细胞数目越多，蛋白表达量越高。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠体质量

干预前，与对照组比较，模型组大鼠体质量明显降低(P<0.01)；与模型组比较，糖通饮各剂量组大鼠体质量均无明显差异(P>0.05)；给药2周和4周时，与对照组比较，模型组大鼠体质量明显降低(P<0.01)；与模型组比较，糖通饮高剂量组大鼠体质量显着升高(P<0.05)，糖通饮低、中剂量组有升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；给药8周时，与对照组比较，模型组大鼠体质量明显降低(P<0.01)；与模型组比较，糖通饮各剂量组大鼠体质量均显着升高(P<0.01)，各剂量组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

注：(1)与对照组比较，P<0.01；与模型组比较，(2)P<0.05，(3)P<0.01。 图1 糖通饮对各组大鼠体质量的影响Fig.1 Effect of Tangtongyin formula on body mass of rats

2.2 FGB

给药前，与对照组比较，模型组大鼠FGB明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，糖通饮各剂量组大鼠FGB差异无统计学意义(P>0.05)。给药8周时，与对照组比较，模型组大鼠FGB明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，糖通饮各剂量组大鼠FGB明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，各剂量组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠给药前后FBG水平的比较Tab.2 Fasting blood glucose before and after drug intervention in rats in each

注：(1)与对照组比较，P<0.01；(2)与模型组比较，P<0.01。

2.3 大鼠胰腺组织AKT及IRS-1 mRNA表达

与对照组比较，模型组大鼠胰腺组织AKT及IRS-1 mRNA表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，糖通饮高剂量组大鼠胰腺组织AKTmRNA表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，糖通饮低、中剂量组有上升趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，糖通饮中、高剂量组大鼠胰腺组织IRS-1 mRNA均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，糖通饮低剂量组有升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

注：(1)与对照组比较，P<0.01；与模型组比较，(2)P<0.05，(3)P<0.01。 图2 糖通饮对大鼠胰腺组织AKT及IRS-1 mRNA表达的影响Fig.2 Effect of Tangtongyin on AKT and IRS-1 signal molecule mRNA in rat pancreas

2.4 大鼠胰腺组织AKT及IRS-1蛋白表达

与对照组比较，模型组大鼠胰腺组织AKT、IRS-1蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，糖通饮高剂量组大鼠胰腺组织AKT蛋白表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，糖通饮低、中剂量组有上升趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，糖通饮各剂量组大鼠胰腺组织IRS-1 的蛋白表达均明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)，但各剂量组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

注：A为免疫组织化学染色结果，B为AKT蛋白直条图，C为IRS-1蛋白直条图；(1)与对照组比较，P<0.01；与模型组比较，(2)P<0.05，(3)P<0.01。 图3 糖通饮对T2DM大鼠胰腺组织AKT、IRS-1蛋白表达的影响(免疫组织化学，×400)Fig.3 Effect of Tangtongyin on AKT and IRS-1protein expression in pancreatic tissues of rats with T2DM(immunohistochemistry，×400)

3 讨论

IR是指胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的能力下降，IR的发生可引起糖代谢紊乱[12]。在T2DM患者中，IR的发生率超过80%，因此，改善T2DM患者的IR状态是治疗T2DM的有效途径[13]。全国名老中医凌湘力教授创制的经验方“糖通饮”是在六味地黄丸的基础上换熟地黄为生地黄，并配伍了黄芪、丹参、地骨皮和草决明，该方根据T2DM气阴两虚为本、瘀血阻络为标的基本病机特点创制而成，具有益气养阴、活血化瘀的功效[10]。据现代药理学研究证实，黄芪中的黄芪多糖是天然的血糖调节剂，具有降糖的作用[14]；丹参可降脂降压[15]，地骨皮、草决明可促进胰岛β细胞分泌胰岛素，有降低血糖的作用[16]。此方在临床治疗T2DM的运用中也取得颇为满意的成果。本研究结果显示，糖通饮可明显降低T2DM大鼠FBG值，提示糖通饮可以改善大鼠的高糖状态；糖尿病模型组大鼠体质量明显降低，可能是由于IR，从而使外周靶组织对葡萄糖的摄取和利用减少，导致蛋白质和脂肪作为能量物质加速分解，促使体质量减轻，糖通饮可增加T2DM大鼠的体质量，此作用可能与改善IR有关。

PI3K-AKT信号通路是胰岛素信号转导的主要途径，也是调控血糖的主要信号通路[10]。正常的胰岛素PI3K-AKT信号通路不仅可减轻IR，还可以促进外周靶组织摄取葡萄糖，对胰岛β细胞分泌胰岛素具有重要作用[17]。当此通路上任何一个因子含量或代谢、分布发生异常都可能导致体内IR的形成，最终诱发T2DM。PI3K-AKT信号通路通过相关因子IRS-1和AKT来调节胰岛素在体内的代谢，可保持血糖的平稳。IRS-1是胰岛素受体后水平的关键分子，介导胰岛素信号传导，其表达量和磷酸化水平是胰岛素正常产生生物学效应的关键[18]。IRS-1上丝氨酸磷酸化可以负反馈抑制IRS-1的活性，与IR的发生有密切关系[19]。AKT是胰岛素信号传导中重要的下游分子，以磷酸化形式被活化，活化的AKT可促进机体糖原合成和葡萄糖转运，增加机体对胰岛素的敏感性，降低血糖水平，是使胰岛素最终发挥效应的关键分子[20]。T2DM由于胰岛素受体表达水平下降，使IRS-1酪氨酸磷酸化水平降低，干扰了PI3K的活化，也因此影响了AKT的活化，从而使胰岛β细胞受损，凋亡增加，胰岛素分泌水平下降，出现血糖升高以及T2DM的一系列表现[21]。激活PI3K-AKT信号转导通路可减轻IR和胰岛β细胞的损伤，对胰岛β细胞具有保护作用[19]。糖通饮干预后T2DM大鼠胰腺组织AKT、IRS-1 mRNA和蛋白的表达量显着升高，表明糖通饮可能通过激活PI3K-AKT信号通路，从而减轻胰岛β细胞损伤和改善IR。

综上，本研究表明，糖通饮可改善高脂饲料联合STZ诱导的T2DM大鼠胰腺损伤，增加T2DM大鼠体质量、缓解FBG的升高，还可通过上调胰腺PI3K-AKT信号通路相关因子IRS-1、AKT mRNA和蛋白的表达，激活大鼠胰腺PI3K-AKT信号通路，从而延缓胰岛β细胞功能衰退，保护胰岛β细胞，改善IR，降低血糖。本研究还发现，高剂量组的糖通饮治疗T2DM的疗效最佳，为优化临床用药剂量的选择提供了实验依据。