Nganguem Nzalle Yranney Brice，毛善永，莫丽莉，林慕之，张蓓，周海燕，王艺明，况春燕，刘兴德,5***
(1.贵州医科大学附院 心血管内科，贵州 贵阳 550004；2.贵州省人民医院 心血管内科,贵州 贵阳 550002；3.贵州医科大学附院 超声科，贵州 贵阳 550004；4.贵州医科大学附院 心理科，贵州 贵阳 550004；5.贵州中医药大学第二附属医院 心血管内科，贵州 贵阳 550025)
Schlafen(Slfn)基因家族是可以调控T淋巴细胞活化及胸腺成熟的一系列重要基因[1-2]。目前Slfn基因家族包括10种鼠源基因，成员蛋白都有一个“Slfn盒”，“Slfn盒”与其临近的ATP/GTP可结合至AAA结构域上，根据蛋白质的长短，该家族蛋白可以分为3个不同亚类[3-4]。Slfn3属于中等长度蛋白，其蛋白亚型有一个由5个氨基酸(Ser-Trp-Ala-Asp-Leu)组成的高度保守 “SWADL”序列[5]。研究表明Slfn家族蛋白可以作用于Cyclin D1抑制细胞的增殖、分化及衰老等[6-7]，但仍有部分功能尚不清楚。本课题组前期研究发现Slfn1可抑制内皮祖细胞的增殖和迁移[8]，但是对于Slfn3的生物行为学调控尚未阐明，为了探讨Slfn3对内皮祖细胞的生物学影响，本研究拟构建携带Slfn3基因的重组腺病毒载体pAdeno-EF1-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG，并在HEK293细胞中完成包装及扩增，获得重组腺病毒rAD-Slfn3，为其在内皮祖细胞中研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1试剂 高保真的PrimeSTAR酶、TaKaRaMiniBEST割胶回收试剂盒、pAdeno-EF1a-MCS-MCMV-EGFP-3FLAG载体、AxyPrep质粒DNA小量试剂盒、无缝克隆试剂盒、T4 DNA连接酶、DH5α感受态细胞及限制性内切酶NheI及测序引物均由华大基因公司提供或合成，并负责进行阳性克隆的测序。
1.1.2仪器 DNA电泳槽、稳压电泳仪及凝胶成像仪购自Bio-rad公司，PCR仪购自Applied Biosystems公司，冷冻高速离心机购自Thermo Fisher公司。
1.2方法
1.2.1pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG的构建 以GeneBank中已经收录的大鼠Slfn3基因(Genebank ID：XM_017597672.1)的cDNA为模板，用VectorNTI软件进行引物设计并对该片段进行PCR，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果，并把目的基因条带从电泳后的琼脂糖凝胶中切割下来，经过胶回收后将目的基因片段和线性化载体反应，连接产物转化到DH5a；挑取阳性克隆提取质粒，经限制性内切酶NheI酶切鉴定，酶切鉴定正确序列送华大基金进行检测，测序正确后命名为pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG，示意图见图1A，测序引物序列为Slfn3-F CTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTT，Slfn3-R CCTCGACTGTGCCTTCTA。
1.2.2细胞培养与腺病毒包装 HEK293细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。利用Admax系统，将穿梭质粒pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG与腺病毒辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染到HEK293细胞中获得重组腺病毒rAD-Slfn3。
1.2.3病毒扩增 将HEK293细胞铺在10 cm皿中，待细胞汇合达到90%以上，加入合适滴度病毒感染细胞，5～6 d后，细胞全部病变，收获细胞将其反复冻融3次，收获病毒并将其分装。
1.2.4病毒滴度测定 取5.0×105个HEK293细胞接种于24孔板，常规培养，将稀释的病毒液加入24孔板中，感染48 h后，倾去培养液，在倒置荧光显微镜观察荧光，估计病毒感染细胞效率，显微镜下数荧光阳性的细胞集落，选择5个视野，在10×的物镜下观察阳性细胞数，计算每孔平均阳性细胞数和病毒滴度。病毒滴度(PFU/mL)=(每个视野下阳性细胞个数×每个视野细胞的个数×稀释倍数)/0.1 mL。
1.2.5Western blot分析 因穿梭质粒上带有Flag标签，rAD-Slfn3感染HEK293细胞48 h后，收集细胞并将其裂解，提取蛋白样本，用Western blot鉴定HEK293细胞是否表达Flag蛋白。
2 结果
2.1穿梭质粒pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG的构建
将割胶回收得到的Slfn3通过线性化载体pAdeno-EF1a-MCS-MCMV-EGFP-3FLAG反应，挑取阳性克隆提取质粒，经限制性内切酶NheI酶切鉴定，发现Slfn3成功插入目标载体中(图1B)。测序分析(图1C)显示pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG包含Genebank公布的Slfn3基因序列，表明pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG构建成功。
注：A为穿梭质粒pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG的示意图，B为PCR电泳结果，C为测序结果。图1 穿梭质粒pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAGFig.1 The map,digestion pattern and Slfn3 sequencesofpAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG
2.2病毒包装
选取测序正确的pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG和辅助质粒共转染HEK293细胞，转染11 d后可见细胞大量漂浮，在荧光显微镜下可见细胞呈绿色(见图2)，收集细胞并获得重组腺病毒rAD-Slfn3。
荧光显微镜 普通光镜图2 转染后11 d镜下HEK293细胞形态(40×)Fig.2 GFP expression in HEK293 cellsunder fluorescence microscope and optical microscope on 11th days after transfection(40×)
2.3转染HEK293细胞Flag标签的表达
检测转染穿梭质粒pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG的HEK293细胞与对照组细胞，结果显示，转染pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG的HEK293细胞可以表达Flag标签，目的基因Slfn3的预测蛋白大小约为67 kDa，其大小与预测一致，而对照组无Flag蛋白表达(见图3)。
注：1为Marker，2为HEK293细胞，3为转染空质粒的HEK293细胞，4为转染穿梭质粒pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG的HEK293细胞。图3 Flag标签的检测(Western blot)Fig.3 Flag expression in HEK293 cells transfected with or without pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG(Western blot)
3 讨论
Slfn家族成员在细胞增殖、分化及其调节免疫应答等方面都有重要作用[9]。研究发现Slfn1、1L、2、3、4、5、8、9、10及14在鼠中表达[10-14]；Slfn5、Slfn11、Slfn12，Slfn13及Slfn14在人体内表达[15-18]。Slfn家族成员在T细胞激活，胸腺成熟等生物学过程中起重要作用。Slfn3最初在鼠睾丸中发现，其在心脏和胸腺中的表达量较低[19]。研究发现，在T细胞激活时，Slfn3的表达明显增加[20-21]。同时，Slfn3也可在CD4+CD25+的循环T细胞中表达，这意味着Slfn3在调控T细胞分化等免疫应答过程中起重要作用[22]。此外，研究发现Slfn3可通过增加p27的表达，抑制CDK2的表达，从而调控细胞周期，抑制细胞增殖[20]。但是，Slfn3是否可以调控心血管系统，对内皮祖细胞增殖及其迁移的影响及机制迄今为止尚未研究。本研究构建穿梭质粒pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG，并将该质粒与辅助质粒共转染HEK293细胞，获得重组腺病毒rAD-Slfn3，在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达，并通过Western Blot鉴定其表达该质粒，为后续探索其对内皮祖细胞的增殖和迁移奠定了实验基础。
构建腺病毒的方法主要有Adeno-X系统、Adeasy系统及其AdMax系统[23]。Adeno-X系统是采用体外直接连接的方法，效率较低，因酶切位点有限，限制了该方法的应用[24-25]。Adeasy系统及其AdMax系统都是运用同源重组的研究原理，Adeasy系统是利用在细菌体内同源重组的原理[26-27]，AdMax系统利用了HEK293细胞内同源重组的原理，利用Cre/loxP重组酶将携带外源基因的穿梭质粒与骨架质粒在HEK293细胞中重组，产生腺病毒[28]，本研究利用AdMax系统获得重组腺病毒rAD-Slfn3，该系统具有效率高、产率高及操作简便等特点。通过上述实验，本研究通过菌落PCR和测序证实该穿梭质粒序列正确后，将其与辅助质粒共转染HEK293细胞中进行包装后鉴定，重组腺病毒感染HEK293细胞后，检测细胞中Flag标签的表达情况，结果发现Flag标签在病毒感染的细胞中表达，确定获得重组腺病毒rAD-Slfn3。
综上所述，本研究成功构建了大鼠Slfn3基因rAD-Slfn3重组腺病毒载体，为研究该基因对心血管系统的调控及其对内皮祖细胞增殖及其迁移的影响奠定了坚实的实验基础。
